KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

Online meting van celdichtheid levert betere kwaliteit en hogere opbrengst

Celculturen spelen een steeds belangrijkere rol bij de productie van vaccins, antilichamen en biofarmaceutica. De conditie van de cellen hangt af van allerlei procesvariabelen, zoals pH, opgeloste zuurstof en CO2-gehalte. Online meting van deze parameters geeft de nodige munitie voor de procesregeling. Echter, methoden die direct iets over de celfysiologie zeggen waren lange tijd alleen als offline meting beschikbaar. Met sensoren voor de online monitoring van de dichtheid van (levensvatbare) cellen kunnen nu direct de benodigde aanpassingen aan de celculturen worden doorgevoerd.

Het online meten van temperatuur, pH, opgeloste zuurstof en CO2-gehalte is onmisbaar voor een goede controle van celcultuurgebaseerde processen. Cellen voelen zich vaak binnen een vrij nauw pH-gebiedje senang en het is zaak om stress door een te hoge of te lage pH te vermijden en de optimale pH voor de productie van de culturen in stand te houden. Met opgeloste zuurstof is het helemaal uitkijken: te weinig zuurstof kan leiden tot apoptose (plotselinge, geprogrammeerde celdood) of anaërobe digestie, wat de levensvatbaarheid van de cultuur en dus de opbrengst drastisch vermindert. Hoe belangrijk deze parameters ook zijn, ze zijn feitelijk alleen indicatief voor het wel en wee van de cellen, geven feitelijk een afgeleid beeld van de celconditie. Ervaren procesoperators komen hier met hun ‘Fingerspitzengefühl’ een heel eind mee, maar voor de echte finesse, de finetuning van de processen hebben ze meer baat bij een direct beeld van de conditie van de celcultuur: hoeveel cellen zijn er per liter suspensie, en nog beter: hoeveel daarvan zijn er ook daadwerkelijk actief, levensvatbaar? Deze parameters – ‘total cell density’ en ‘viable cell density’ – konden tot voor enkele jaren geleden alleen offline worden bepaald. En dat is niet handig, want dan moet je veel te lang wachten op meetresultaten om nog adequaat met je procesregeling te kunnen reageren. Met de Incyte en Dencytee sensoren van Hamilton kunnen deze parameters wel online worden bepaald, zodat continu uit de eerste hand (immers van de cellen zelf) informatie over cellen beschikbaar is en afwijkingen, hoe klein ook, direct kunnen worden gedetecteerd.

Sensoren voor de online monitoring van de dichtheid van (levensvatbare) cellen
staan aan de basis van een verbeterde regeling van celcultuurgebaseerde processen.

 

Monitoring van totale celdichtheid

Bij monitoring van de totale celdichtheid worden zowel levende als dode cellen gemeten, evenals andere deeltjes. Deze methode is het meest betrouwbaar voor het bepalen van de celgroei in de beginstadia van een celcultuur, waarbij snelle expansie plaatsvindt. Relevante informatie wordt verkregen tijdens de ontwikkelings- en groeifase voordat significante celdood optreedt. De Dencytee sensor bepaalt de totale celdichtheid door het optisch meten van de troebelheid van de celsuspensie. Dit gebeurt in het nabij-infrarood gebied, bij een golflengte van 880 nm. Alle deeltjes en moleculen die licht absorberen of verspreiden bij 880 nm worden gedetecteerd, inclusief levende cellen, dode cellen en celresten. Voordeel van het meten bij deze golflengte is dat de bepaling ongevoelig is voor kleurveranderingen in het medium. De technologie is zo gevoelig dat al in een vroegtijdig stadium procesafwijkingen aan het licht kunnen komen.

 

Monitoring van levensvatbare celdichtheid

Online monitoring van de levensvatbare celdichtheid levert direct informatie over de meest relevante parameter: de levende, actieve cellen die zorgen voor de productie. Hiermee wordt inzicht verkregen in de ontwikkeling van de celcultuur en kan het begin van de fase waarin celdood optreedt nauwkeurig worden vastgesteld. Ook geeft deze parameter inzicht in veranderingen in de celfysiologie. Op basis van de informatie over procesveranderingen kan worden bepaald welke stappen moeten worden genomen om de opbrengst te maximaliseren. Net als bij de monitoring van totale celdichtheid hoeft hierbij niet te worden bemonsterd. Het meetprincipe van de Incyte sensor, die realtime, online meting van levensvatbare cellen in oplossing mogelijk maakt, is gebaseerd op elektrische capaciteit. In een alternerend elektrisch veld gedragen levensvatbare cellen zich als kleine condensatoren; bij dode cellen gebeurt dat niet omdat het membraan beschadigd is. De lading van deze kleine condensatoren wordt door de sensor gemeten en gerapporteerd als permittiviteit (de mogelijkheid van een materiaal om elektrische energie op te slaan in een elektrisch veld) met als eenheid pF/cm. De permittiviteit van levende cellen wordt gemeten bij frequenties die specifiek zijn voor bepaalde celtypes: in de regel 1 MHz voor zoogdiercellen en bacteriën, en 2 MHz voor gistcellen. Naast de metingen bij 1 of 2 MHz wordt ook bij hele hoge frequenties gemeten om de achtergrond-permittiviteit te bepalen, waarmee de meting van de levensvatbare cellen kan worden gecorrigeerd. Meer fysiologische informatie over de levensvatbare cellen kan worden verkregen met behulp van een scan bij verschillende frequenties. De Incyte scan meet hiervoor de permittiviteit bij 17 verschillende frequenties in het gebied tussen 0,3 en 10 MHz. Op basis van het gegeven dat levende cellen volledig polariseren bij lage frequenties en nauwelijks bij hoge, kan bijvoorbeeld de gemiddelde diameter van cellen worden bepaald. Zet je deze parameter uit in de tijd, dan krijg je daar betrouwbare informatie uit over de groei van de celcultuur en de homogeniteit ervan.

 

Proef op de som

In een pilot project met een cultuur van eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO; Chinese Hamster Ovary) voor de productie van monoklonale antilichamen is de online meting van totale celdichtheid en levensvatbare celdichtheid gecombineerd met de meting van de traditionele parameters als pH en opgeloste zuurstof. Hierbij kwam duidelijk naar voren dat de kleinste procesveranderingen, die van grote invloed kunnen zijn op de celgroei binnen deze kostbare processen, kunnen worden gedetecteerd. Veel beter dan met pH en opgeloste zuurstof alleen, die immers alleen indirect iets zeggen over de toestand van de cellen. Omdat de biologische processen nu veel transparanter zijn kunnen ze ook beter worden geoptimaliseerd. Dit brengt ook efficiëntere en meer gestandaardiseerde procedures met zich mee, niet in de laatste plaats omdat de snelheid en de betrouwbaarheid van de metingen is toegenomen.

 

Hamilton Process Analytics

zdevente@hamilton.ch

www.hamiltoncompany.com

BLIKVANGERS

CONTACT

ABONNEMENT