KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 39, OKTOBER 2019

 

In één stap complexe verbindingen synthetiseren met multicomponent reacties

De Groningse vakgroep ‘Drug Design’ van Alexander Dömling is in acht jaar tijd uitgegroeid van twee naar meer dan dertig onderzoekers. Als voorloper op het gebied van multicomponent reacties (MCR’s) is de vakgroep een magneet voor onderzoekers van over de hele wereld. André Boltjes is er al vanaf het begin bij, als analist, labmanager en onderzoeker. Eind dit jaar hoopt hij er te promoveren.


André Boltjes, labmanager van de Groningse vakgroep ‘Drug Design’, bij het recent aangeschafte Pure flash chromatografie-apparaat van Büchi Labortechnik voor het opzuiveren van verbindingen die in één stap met multicomponent reacties worden gesynthetiseerd.


Met vier flash chromatografieapparaten continu in gebruik is er bij de vakgroep ‘Drug Design’ capaciteit voor meer dan 8.000 opzuiveringen per jaar. “Die capaciteit hebben we hard nodig. Het aantal onderzoekers groeit nog steeds. En die werken aan multicomponent reacties, een synthesetechniek waarmee je in korte tijd grote hoeveelheden verbindingen kan maken. Hierdoor is het opzuiveren bij ons echt lopende band werk geworden”, vertelt senior analist en labmanager André Boltjes, die sinds 2007 bij de vakgroep werkt, waar het vanaf 2011, met de aanstelling van MCR-pionier Alexander Dömling, heel hard is gegaan.

 

Multicomponent reacties

Met multicomponent reacties (MCR’s) kan je veel efficiënter tot nieuwe verbindingen komen dan via de traditionele benadering, waarbij je een verbinding opbouwt aan de hand van een retrosynthetische analyse. “Bij retrosynthetische analyse weet je wat je wilt maken. Je gaat dan met je chemische kennis stap voor stap terugredeneren van waaruit je dat kan maken. Totdat je uitkomt op stoffen die commercieel verkrijgbaar zijn. Die koop je in om daarmee in het lab de reacties, die je hebt bedacht, stap voor stap uit te voeren. Bij iedere stap is een zuiveringsstap nodig, bijvoorbeeld met flash chromatografie, om een zo zuiver mogelijk intermediair voor de volgende stap te hebben. Syntheses van vijf tot tien stappen zijn hierbij geen uitzondering. Dus je kunt begrijpen dat daar veel tijd en ook veel materiaal mee gemoeid is. Bij MCR doe je alles in één keer. Je start hierbij met drie of meer uitgangsstoffen, die zo zijn gekozen dat ze in hetzelfde mengsel netjes op hun beurt met elkaar reageren. Het algemene mechanisme is op basis van reactiviteit. De eerste twee reageren met elkaar. De intermediate die daaruit ontstaat is reactief genoeg om met een derde component te reageren en die weer met een vierde. Het gaat netjes op volgorde, zodat je één hoofdproduct zonder al te veel bijproducten krijgt. Door het slim kiezen van de uitgangsstoffen kan je in die ene stap bepaalde eigenschappen introduceren.

Een verbinding moet bijvoorbeeld actief kunnen zijn in het lichaam, bepaalde eiwitten remmen. Op sommige plekken in het eiwit heb je mogelijke interacties, zoals met een aromaatring. Dan pakken we bijvoorbeeld als onderdeel van een MCR een amineverbinding, een benzylamide. Op die manier kunnen we in de te maken verbinding een aromaatring introduceren”, legt André Boltjes uit. Er zijn inmiddels tientallen MCR’s in de literatuur beschreven. Vanuit elk van die mechanismen heb je een bijna onuitputtelijke bron (zeker praktisch gezien) aan mogelijkheden voor de synthese van nieuwe verbindingen. Een viercomponenten reactie waar ook in Groningen veel mee wordt gewerkt is de Ugi reactie. Hierbij wordt een amine, een carbonzuur, een aldehyde of keton en een isocyanide gebruikt. Dat lijkt op het eerste gezicht een vrij beperkte set, maar als je alleen al voor elk van die vier groepen tien verschillende verbindingen inbrengt, heb je al 10 x 10 x 10 x 10 is 10.000 verbindingen die je op deze manier kan synthetiseren. “Maar er zijn veel meer mogelijkheden per groep dan die tien uit het rekenvoorbeeld. Alleen al met een Ugi reactie kan je veel meer verbindingen maken dat wat tot nu toe bekend is aan chemische verbindingen”, zegt André Boltjes.


Door de sterke groei van de vakgroep is het aardig passen en meten geworden om voor ieder van de inmiddels meer dan dertig onderzoekers een eigen zuurkast beschikbaar te hebben. De bouw van een nieuw laboratorium voor geautomatiseerde nanosynthese biedt wellicht enige verlichting.

 

Bottleneck vermijden met flash

Met de mogelijkheid om honderden reacties per dag in te zetten, moet je ook procesmatig de opzuivering goed voor elkaar hebben. “In het begin voerden we de opzuivering handmatig uit met kolommetjes met silica. Daar ging bij een groeiend aantal te zuiveren verbindingen op een zeker moment, met zo’n 1 tot 2 uur per opzuivering, teveel tijd inzitten. Bovendien kostte dat ook veel oplosmiddelen. We hebben toen een tweetal flash chromatografie apparaten aangeschaft om dat proces te automatiseren en te versnellen tot ongeveer 20 tot 30 minuten per opzuivering.

Bovendien slaagden we erin om het oplosmiddelgebruik met een derde tot de helft van het aanvankelijke gebruik terug te dringen”, vertelt André Boltjes. Vanwege verdere groei in het aanbod is inmiddels al weer een vierde flash chromatografie apparaat aangeschaft. De nieuwste is een Pure flash preparatieve chromatografiesysteem van Büchi Labortechnik.

Dit nieuw ontwikkelde apparaat is de opvolger van de Revelerissystemen, die tot voor enkele jaren bij Grace en sindsdien bij Büchi verkregen konden worden. De twee andere flash chromatografie systemen die al langer in Groningen worden gebruikt zijn Reveleris-systemen. Naast een UV-detector hebben alle systemen ook een ELSD, waarmee je ook niet-chromofore verbindingen kan detecteren. Die zie je niet met UV. Met de flash-apparaten is inmiddels een geolied proces ontwikkeld. “We hebben een vast systeem voor opzuivering van apolaire verbindingen, met loopvloeistoffen op basis van methanol-dichloormethaan. Een andere is voor de meer polaire verbindingen; daar gebruiken we ethylacetaat-petroleumether. Door deze manier van werken kan je tussen de zuiveringen volstaan met een enkele wasstap, zodat de verschillende onderdelen in het systeem langer goed blijven. Bovendien dwing je door het scheiden van oplosmiddelen de onderzoekers tot het goed uitdenken van methode-ontwikkeling: moet links- of rechtsom. Methode-ontwikkeling op de Pure is, net als bij andere flashapparaten, eenvoudig. Je kunt binnen een paar minuten je methode maken, die je ook nog eens tijdens de run kan aanpassen. Als het echt niet anders kan, dan hebben we nog een combi-flash opstelling, met vier oplosmiddelen. En voor de echt moeilijke gevallen, als het niet lukt met één van de Büchi’s, maken we handmatig een kolom.” Wachtrijen zal je nooit aantreffen bij de apparaten. Aanvankelijk werd gewerkt met intekenlijsten, wat echter met de toenemende drukte steeds vaker tot vertragingen leidde: mensen hadden het vergeten, hadden hun monsters nog niet klaar. Nu staat er bij ieder apparaat een rekje waar de onderzoekers hun sample cartridge inzetten, met hun naam erop. Als ze aan de beurt zijn worden ze geroepen en kunnen ze direct de opzuivering in gang zetten.


Ook de nieuwste rotatieverdampers van Büchi draaien overuren in de laboratoria van ‘Drug Design’.

 

Geautomatiseerde synthese

Aan de hand van MCR worden verbindingen op mmol-schaal gemaakt, zo rond de 200 tot 400 mg per eindproduct. Goed te hanteren en voldoende voor NMR, LC-MS en testen in enkele assays. Het kan echter op een nog kleinere schaal, waarbij ook nog eens veel meer verbindingen sneller worden gesynthetiseerd. Waar de ‘klassieke’ MCR is gebaseerd op verbindingen synthetiseren, opzuiveren en testen, kan met de nieuwe methode de opzuiveringsstap worden overgeslagen en kunnen de gesynthetiseerde verbindingen direct zonder verdere bewerking worden getest, op basis van bijvoorbeeld affiniteit met een bepaald enzym. Cruciaal apparaat bij deze ‘acoustic droplet ejection’ (ADE) methode is een ‘acoustic dispenser’, een Echoapparaat dat met geluidsgolven telkens een heel klein druppeltje van 2 nanoliter omhoog schiet. Die gaat niet lukraak de lucht in, maar komt precies terecht in een welletje van een microtiterplaat, dat er op zijn kop boven hangt. Door de adhesie blijft het druppeltje in het welletje hangen, en kan er een druppeltje met een tweede, derde of vierde component worden bijgeschoten. Na menging vinden de reacties plaats volgens hetzelfde procédé als bij MCR. Bij gebruik van een 1536-wells plaat, die door een robotarm nauwkeurig bij ieder tikje op de juiste plaats wordt gemanoeuvreerd, kan je zo in circa 2,5 uur 1536 verschillende reacties laten plaatsvinden.

In een pilot met ADE, dit voorjaar, is getest of de verbindingen die de onderzoekers op het oog hadden ook werkelijk werden gevormd met deze nieuwe methode. Dat was in 70% tot 80% het geval. “De hoge succes rate bij onze allereerste ADE-experimenten stond mede aan de basis van ons plan om substantieel op deze nieuwe technologie te gaan inzetten. We zijn nu bezig met de bouw van een nieuw lab waarin we alles gaan combineren: het maken van de stockoplossingen voor in de moederplaten, een tafel met het Echo-apparaat en een robotarm die de plaat manoeuvreert en ook naar de massaspectrometer brengt voor analyse. Met een nagenoeg volledig geautomatiseerd proces verwachten we dan per dag tussen de 3.000 en 6.000 verbindingen te kunnen synthetiseren en analyseren”, vertelt André Boltjes enthousiast.

 

Geen opzuivering meer nodig?

Met het uitsparen van een opzuiveringsstap lijkt het laatste uur voor de Büchi’s geslagen in Groningen. Niets is echter minder waar: ‘We kunnen inderdaad zo’n microtiterplaat direct naar een onderzoekspartner doorsturen om te testen op activiteit. Maar dat is dan wel een onzuiver mengsel. De verbindingen waarbij activiteit wordt gemeten, gaan we dan alsnog op grotere schaal synthetiseren en opzuiveren. Op die manier zal het aantal opzuiveringen eerder toe- dan afnemen.

En laten we ons gelukkig prijzen dat we niet elke verbinding die we met ADE gaan maken hoeven op te zuiveren. Als je het rekensommetje van 2.000 opzuiveringen per jaar per apparaat doortrekt naar de dagaantallen met ADE, zouden er – wil je alles opzuiveren– honderden extra Büchi’s op het lab komen te staan!”

 

Büchi Labortechnik

www.buchi.nl

 

Vakgroep ‘Drug Design’

www.drugdesign.nl

 

 

Stappen maken in ‘early drug discovery’

Drug discovery, zoals dat al tientallen jaren min of meer op dezelfde manier plaatsvind, is traag, duur en heeft een slechte voorspellende waarde. Dat is de visie van Alexander Dömling, hoofd van de vakgroep ‘Drug Design’. Met een meer dan 10 miljoen euro kostende initiële high-throughput screening (HTS) aan de hand van in vitro assays op een bibliotheek van een miljoen stoffen of meer ben je al minstens een jaar kwijt bent. Het daaropvolgende proces, van hits uit de HTS naar leads, is ook niet efficiënt, want nog altijd gebaseerd op de DTMA-cyclus: ‘design, make, test & analyze’, die slechts in beperkte mate parallel kan plaatsvinden en per cyclus 4 tot 6 weken duurt. Bovendien zit in die grote bibliotheken, die veelal voortborduren op de twintig meest populaire reactiemechanismen, veel minder structurele variatie dan er in de ‘chemical space’ voorhanden is. Het volledige potentieel wordt dus niet benut.

Met multicomponent reacties (MCR’s) kan je heel efficiënt en goedkoop een veel diverser scala aan verbindingen synthetiseren. Met de recente ontwikkelingen op het gebied van ‘acoustic droplet ejection’ (ADE) wordt dat proces nog verder verbeterd, niet in de laatste plaats door de directe koppeling met massaspectrometrie en bio-assays.
Toepassing van AI-technieken als genetische algoritmes en multiparameter optimalisering maken de data-analyse van dergelijke assays een stuk efficiënter, waardoor ook weer betere finetuning kan plaatsvinden bij de MCR’s. MCR bedrijven is geen random proces; ziektebeeld en target, veelal eiwitten die een rol spelen in dat ziektebeeld, zijn richtinggevend.
Vanuit de 3D-kristalsctructuren van dergelijke eiwitten, die in de PDB (‘protein databank’) te vinden zijn wordt onderzocht wat voor soort verbinding in dat target zou passen. Dat gebeurt onder andere op basis van computational chemistry en een eigen ontwikkelde tool (‘anchor query’), een zoekmachine waarin je het eiwit en de farmacofore punten, waarvan wordt verwacht dat de binding enigermate correleert met een therapeutisch effect, invoert. Resultaat van zo’n zoekopdracht is een lijstje met verbindingen die daar mooi inpassen en die zijn gesynthetiseerd met MCR op basis van commercieel verkrijgbare startmaterialen.

De drug-like verbindingen uit dit lijstje kan je vervolgens gaan maken in het lab en screenen op het eiwit. Op basis daarvan kan je optimaliseren en kan in sommige gevallen een molecuul, al dan niet gepatenteerd, zijn weg vinden naar de farmaceutische industrie, waar het nog een lange weg te gaan heeft in het mijnenveld van de klinische testen.