KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 39, OKTOBER 2019

 

Complexiteit van slangengif ontrafelen met CZE-MS

Met honderden componenten is slangengif zeer complex om te analyseren. Neem daarbij dat de samenstelling tussen en binnen soorten sterk kan variëren en dat het lastig is om aan voldoende monstermateriaal te komen, dan kan je je wel voorstellen dat weinig analytici zich wagen aan het structureel in kaart brengen van slangengif. Rob Haselberg, assistant professor bij de VU-vakgroep Bioanalytische Chemie pakt met behulp van CZE-MS die uitdaging wel op.



Rob Haselberg: “Juist omdat we met zulke minimale monsterhoeveelheden moeten werken voor zowel de CE-analyses als de bio-assays, is het essentieel om te kunnen vertrouwen op betrouwbare en nauwkeurige klein-volume pipetten. Hiervoor gebruiken we pipetten van Gilson, die inmiddels zo inherent zijn aan ons labwerk dat we er nauwelijks bij stilstaan dat ze altijd doen wat ze moeten doen.”

Sinds enkele jaren staan slangenbeten op de WHO-lijst van verwaarloosde tropische ziektes. Met jaarlijks rond de twee miljoen slangenbeten die het leven kosten aan meer dan 100.000 mensen en bij een kleine half miljoen mensen blijvend letsel veroorzaken kan je ook niet meer om de impact van deze verwondingen heen. Een verwaarloosde tropische ziekte staat bijna synoniem voor een beperkte interesse vanuit de farmaceutische industrie om daartegen geneesmiddelen te ontwikkelen. Dat is ook bij slangenbeten het geval, maar hier spelen enkele slangspecifieke factoren die het ook nog eens heel erg moeilijk maken om tot een effectief geneesmiddel te komen. Dat heeft vooral te maken met de samenstelling van het gif en de sterke variatie van die samenstelling tussen en zelfs binnen de vele soorten.

Een gemiddeld slangengif bestaat uit 50 tot 200 componenten, zoals enzymen, non-enzymatische polypeptides, peptides, nucleosiden, lipiden, amines en metalen. Binnen de enzymen worden vier hoofdgroepen onderscheiden, die voor een belangrijk deel verantwoordelijk zijn voor de hemo-, neuro- en/ of cytotoxische effecten van het slangengif. Dit zijn fosfolipases A2, ‘snake venom metalloproteinases’, ‘snake venom serine proteinases’ en drie-vingerige toxines. Ook aan de andere componenten binnen de gifcocktail worden bepaalde toxische effecten toegekend, met name de polypeptides, maar ook sommige metalen die als cofactor mogelijk hun steentje bijdragen aan het afweergeschut van de slang.

 

Kleine hoeveelheden

Om slangengif structureel in kaart te brengen zagen de analytici van de vakgroep Bioanalytische Chemie van de VU –geleid door Rob’s collega Jeroen Kool– zich voor verschillende uitdagingen gesteld. “Op de eerste plaats is het helemaal niet zo gemakkelijk om aan slangengif te komen. Via Jeroen’s contacten met het Tropical Institute in Liverpool, die zelf slangen hebben, was dat mogelijk. Het gif wordt gemolken. Dat gaat bij de ene soort heel gemakkelijk, maar er zijn ook soorten die slechts in hele uitzonderlijke gevallen gif spuiten. In mijn CE-gedeelte van het onderzoek hebben we ons gefocust op drie hoofdfamilies, waarbij we vooralsnog het gif van 12 slangensoorten analyseren. Hierbij gaan we pragmatisch om met de verschillende hoeveelheden gif die we per soort konden krijgen: de grote monsterhoeveelheden gebruiken we voor methode-ontwikkeling en de analyses; met de meer zeldzame giffen –het gaat dan om gevriesdroogde monsters van een paar milligram– beperken we ons tot de analyses”, vertelt Rob Haselberg.

 

Capillaire elektroforese

De beschikbaarheid van kleine monsterhoeveelheden was een van de redenen om te kiezen voor CE. “Met deze scheidingstechniek hebben we intrinsiek heel weinig injectievolume nodig; een paar microliter in een sample vial is voldoende. Hierdoor kunnen we meerdere experimenten met de monsters doen. Bovendien willen we analyses doen op intacte eiwitten. Dat is op zich nog steeds best ingewikkeld. Gezien vanuit de scheidingskant plakken die eiwitten overal aan vast. Tot een paar jaar geleden waren de chromatografiekolommen daar echt niet geschikt voor.

Dat wordt nu steeds beter, maar voor LC heb je weer veel meer monstermateriaal nodig. En een laatste argument voor CE is natuurlijk dat we in Amsterdam heel veel expertise hebben met alle vormen van deze techniek. Voor mij zit die vooral in de biofarmacie, waar je ten opzichte van slangengif in een luxepositie zit: analyse van een eiwit met zeg tien varianten, die netjes in een histidinebuffertje is geformuleerd, is wel andere koek dan de analyse van mogelijk honderden componenten, die ook nog eens allemaal hun varianten hebben. Die diversiteit maakt het zeer ingewikkeld”, aldus Rob Haselberg.

Juist vanwege de complexiteit van de monsters was het idee om eerst meer informatie te genereren over het monster, en van daaruit methodes te optimaliseren. “Vanuit de expertise van Jeroen’s mensen en de literatuur weten we zeker wel iets over de fysisch-chemische eigenschappen van deze eiwitten. In een overleg met Jeroen over eiwitkarakterisatie kwam het idee op om eens met verschillende CE-varianten te kijken of we meer informatie uit het totale monster kunnen  krijgen. Wat voor massa ranges kunnen we vinden? Hoe is de verdeling van het iso-elektrisch punt? Op basis van die informatie kunnen we dan besluiten om onze andere (meer routine) methodes aan te passen om betere analytiek te kunnen doen. Wat daarbij ook meespeelt is dat we nog nooit aan dergelijke complexe monsters hebben gemeten met CE. Vanuit analytisch oogpunt is het dus razend interessant om te achterhalen of dat mogelijk is met methodes die van oorsprong ontwikkeld zijn voor simpelere mengsels.”

 


Kijkje in één van de instrumentele labs van de vakgroep Bioanalytische Chemie, die sinds een kleine vier jaar is gevestigd in het O|2-gebouw van de Vrije Universiteit.

 

Universele methode

De eerste stap om meer vat te krijgen op het complexe monster is CGE, capillaire gelektroforese. Deze CE-techniek zegt iets over de verdeling van de molecuulgewichten. De resolutie is relatief laag en ook vanwege UV-detectie is het lastig iets te zeggen over individuele componenten. Je ziet wel regio’s, zoals alles onder 10 kDa, componenten tussen de 10 kDa en 20 kDa, enzovoorts. Zo’n profiel geeft wel enig inzicht in het gif: zitten er relatief veel hoog- of juist veel laagmoleculaire componenten in? Omdat de CGE-experimenten zowel met gereduceerde als niet-gereduceerde monsters plaatsvinden kan je ook iets zeggen over de hoeveelheid non-covalente complexen.

Bij ‘non reduced’ meet je aan het intacte eiwit. Na een voorbehandeling, waarbij al die eiwit-eiwit interacties worden verbroken, meet je het ‘reduced’. De verschillen zie je terug in de verschoven profielen van de molecuulgewichten. De tweede stap in de voorbereiding voor je CZEMS is CIEF: capillaire iso-elektrische focussing. Met deze techniek kijk je naar de ladingsverdeling van het intacte monster en genereer je een patroon met verschillende pI-pieken. Op basis van CGE en CIEF kom je dan tot de optimale instellingen voor de uiteindelijke analyse, de CE-MS. Omdat CIEF en CGE niet direct CE-MS compatibel zijn, moet je voor het CE-deel CZE (capillaire zone-elektroforese) toepassen. Hierbij is het zaak de goede pH kiezen voor je scheidingsbuffer in combinatie met een goed coating van het capillair om er voor te zorgen dat die eiwitten niet overal aan blijven plakken. Op basis van je CGE kan je je instelling voor MS aanpassen: focus je je op de ‘small molecules’? Of ga je voor de grote eiwitten? Ga je wellicht iets missen?

Tot op heden is Rob Haselberg er met zijn medewerkers (master- en HBO-studenten, zie kader) in geslaagd om een goede CZE voor het hele mengsel te creëren, voor alle onderzochte slangengiffen. “Het is dus een universele methode, waarbij zelfs refractionering op pI niet noodzakelijk is. De eerste ‘proof of-principle’ experimenten laten zien dat we een aantal componenten kunnen identificeren, ook bij reeds eerder geanalyseerde slangensoorten, die hierbij als een soort van benchmark functioneren. Ook zien we duidelijke verschillen tussen verschillende slangensoorten: bij sommige soorten zijn er grote onderlinge verschillen, terwijl andere soorten weer sterk overeenkomende profielen hebben binnen families.” Punt van aandacht is nog de interface tussen CZE en MS. “Het klassieke interface is een ‘sheath liquid interface’. Dan gebruik je een extra vloeistof, die je bijmengt aan het einde van je capillair om het elektrisch contact te volbrengen. Daarmee introduceer je echter ook een verdunning van je CE-vloeistof. Dat is geen probleem voor identificatie van de ‘main components’. Maar we zien in de basislijn van de UV nu ook nog allerlei pieken die we in de MS niet terugzien. Voor die componenten is de verdunning te sterk. In het najaar gaan we derhalve met een nieuw ontwikkelde interfacetechniek, CESI, aan de slag die een factor 100 gevoeliger is.”

CE-scheiding van gif van twee verschillende soorten slangen.

 

 

Bio-assays

Waar het werk momenteel gericht is op het analyseren van de monsters, kijkt Rob Haselberg ook vooruit, naar wat er met de analytische resultaten kan worden gedaan. “Algemeen gesteld hopen we dat we op den duur betere antigiffen kunnen maken omdat we beter snappen wat er precies in het gif zit. Daar kunnen we in samenwerking met de groep van mijn collega Jeroen Kool ook in onze vakgroep al een behoorlijke draai aan geven.

Onderzoekers van deze groep hebben namelijk specifieke assays voor neuro-, hemo-, en cytotoxische effecten ontwikkeld. Met deze gevalideerde, eenvoudig uit te voeren kleur- of klonteringsassays kunnen we bijvoorbeeld bepaalde fracties testen, zoals die uit onze CZE-MS naar voren zijn gekomen. Op den duur zou je dan bepaalde geïdentificeerde componenten of groepen van componenten kunnen koppelen aan een bepaald effect. Die componenten kunnen dan door farmaceutische bedrijven als uitgangspunt worden genomen voor het ontwikkelen van selectieve medicijnen.”

 

Het hart van een CE apparaat is het capillair waar in het geval van CIEF door het aanleggen van een potentiaalverschil de componenten op pI worden CE-scheiding van gif van twee verschillende soorten slangen. gescheiden.

 

Digitaal pipetteren

Zover is het nog niet, niet in de laatste plaats omdat je voor die assays ook weer materiaal nodig hebt. “De hoeveelheden die we met CE opbrengen zijn niet toereikend voor de bio-assays. Daarvoor gebruiken we toch chromatografische benaderingen, waar je wat meer volume kan opbrengen en dus ook beter kan fractioneren. Een belangrijke stap in dat proces is de monstervoorbewerking.

“Juist omdat we met zulke minimale monsterhoeveelheden moeten werken voor zowel de CE-analyses als de bio-assays, is het essentieel om te kunnen vertrouwen op betrouwbare en nauwkeurige klein-volume pipetten. Hiervoor gebruiken we pipetten van Gilson, die inmiddels zo inherent zijn aan ons labwerk dat we er nauwelijks bij stilstaan dat ze altijd doen wat ze moeten doen. Omdat onze assays kleinschalige experimenten zijn pipetteren we nog handmatig; een pipetteerrobot is voor dit werk overgedimensioneerd. We gaan wel testen doen met een nieuwe Gilson-pipet, waarbij samples automatisch via Bluetooth worden gelogd. Dat past uitstekend bij de slag naar digitaal die we binnen de universiteit momenteel aan het maken zijn richting ELN’s, de electronic lab notebooks. Dan wordt ook alles netjes bijgehouden als je aan het pipetteren bent. Dat zou geweldig zijn!”

 

Gilson International

www.gilson.com

 

Vakgroep Bioanalytische Chemie

science.vu.nl/en/research/chemistry-pharmaceutical-sciences/research/analytical-chemistry



Een stageplek voor 145 studenten

Naast assistant professor is Rob Haselberg sinds een paar maanden ook coordinator van de track ‘analytical sciences’ binnen de gezamenlijk master chemie van de VU/UvA. Dat betekent dat hij –samen met een collega van de UvA– voor zo’n 145 studenten die voor deze tweejarige track hebben gekozen inhoudelijke vraagbaak is voor onder andere het zoeken van stageplekken, literatuurscriptie onderwerpen en samenstelling van vakkenpakketten. Verder kan hij advies geven bij allerlei andere grote en kleine problemen, waar hij zich vaak kan beperken tot doorverwijzen naar een studentenpsycholoog of studie-adviseur.

Ook docenten, die vragen hebben over studenten, weten Rob te vinden. Dankzij een goed extern netwerk is het plaatsen van studenten voor een stage bij een bedrijf of ziekenhuis geen al te grote opgave. Daarnaast kunnen jaarlijks een kleine 30 studenten bij de analytische vakgroepen van de VU en de UvA worden geplaatst. Om dit proces nog efficiënter te laten verlopen is Rob samen met collega’s gestart met het online plaatsen van projecten, zodat er direct contact kan worden gelegd tussen student en stageplek, en de intermediaire rol van de coördinator minder nodig is.