KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 36, SEPTEMBER 2018

Cell imaging reader geeft meerwaarde aan simulator spijsvertering

In tien jaar tijd is het Gentse bedrijf ProDigest uitgegroeid tot wereldwijd markt- en technologieleider op het gebied van in vitro simulatie van het spijsverteringsstelsel. Het daarvoor gebruikte platform SHIME® (‘Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem’) wordt continu doorontwikkeld en uitgebreid. Met de recente investering in een cell imaging reader speelt het bedrijf in op de groeiende vraag naar het meten van effecten met allerhande celgebaseerde assays.

Massimo Marzorati is CEO van ProDigest dat de afgelopen jaren (2016 en 2017) twee keer op rij de prijs ontving voor het snelstgroeiende life science bedrijf in België in Deloitte’s Technology Fast 50 ranking.

Poep. Daar ruikt het onmiskenbaar naar in de laboratoria van ProDigest waar in reactoren het spijsverteringsstelsel wordt nagebootst. Massimo Marzorati, CEO van het bedrijf, haalt er zijn schouders bij op: “Wij zijn er hier wel aan gewend met twintig darmsimulatoren in het laboratorium, en bovendien is de geuroverlast stukken minder dan op de vorige locatie, in een kelder van de de faculteit Bio-ingenieurswetenschappen van de Universiteit Gent, waar ik samen met Sam Possemiers en Willy Verstraete in 2008 de spin-off ProDigest heb opgericht. Daar waren de afzuiging en ventilatie stukken minder dan in dit bio-incubator gebouw van het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB) op het Technologiepark in Zwijnaarde waar we sinds 2012 zijn gehuisvest, en waar we snel konden doorgroeien naar een bedrijf met momenteel 37 mensen.” Het idee achter de spin-off was om de serviceactiviteiten rond de simulator, –een combinatie van reactortechnologie (engineering) en microbiologie, die al in 1993 op de universiteit was ontwikkeld– naar de mark te brengen. Steeds vaker benaderden bedrijven uit met name de voedselindustrie de universiteit om op de simulator specifieke ingrediënten te testen. Omdat een onderzoeksorganisatie niet is ingericht voor dat soort commerciële activiteiten kwam dat niet van de grond. Maar Massimo, Sam en Willy zagen hun kans schoon, mede omdat in die tijd de Europese wetgeving rond etikettering van pre- en probiotica was aangescherpt en bedrijven op het gebied van functional foods meer in research zouden gaan investeren. Dat klopte, want met de behaalde inkomsten kon al snel een tweede systeem worden ontwikkeld. Dit legde de basis voor verdere groei op basis van diversificatie van de services naar andere markten, zoals met name de farma (voor ondermeer screening van potentiële geneesmiddelen), maar ook feed en pet food.

 

Reactortechnologie en microbiologie

De SHIME® (‘Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem’) is een simulator van het spijsverteringsstelsel, op het gebied van zowel fysiologie als microbiologie. Basis van het systeem zijn vijf achtereenvolgende reactoren die respectievelijk de processen in de maag, de dunne darm en dan drie compartimenten van de dikke darm, de colon ascendens (stijgende gedeelte), de colon transversum (het dwarslopende deel) en de colon descendens (dalende gedeelte) simuleren. In de maag komt het voedsel het systeem binnen. De pH gaat omhoog, waarop de maag maagzuur en pepsines produceert. Die worden in de simulator aan het systeem toegevoegd, in combinatie met enkele zouten. De pH daalt dan en dan wordt het voedsel geleidelijk getransporteerd naar de dunne darm, waar galzouten, alvleeskliersappen en carbonaten de pH weer omhoog brengen. Met de computer kunnen de condities in de dunne darm worden gemodificeerd, zodat ze representatief zijn voor de drie delen van de dunne darm: het duodenum, jejenum en ileum. Afhankelijk van het soort simulatie-experiment zal er vertering van het voedsel en vervolgens absorptie van afbraakcomponenten plaatsvinden via een dialyse unit. Wat niet is verteerd gaat de dikke darm in en vormt een koolstofbron voor bacteriën. In de transitie van de drie fases komen ze microbiota tegen die zijn afgeleid van fecale monsters van een donor. Die donor is ook weer afhankelijk van het type experiment: voor een ‘adult healthy condition’ gebruik je de fecaliën van een gezonde volwassene. Bij de baby-SHIME® voor baby’s tussen 0 en 6 maanden of 6 maanden tot 2 jaar worden monsters van de betreffende baby’s gebruikt. Het grootste kunstje dat uit de combinatie van reactor- en microbiologische expertise voortkomt speelt zich af in de dikke darm secties, waarbij het is gelukt om de enorme diversiteit van een fecaal monsters in stand te houden en representatief te maken voor elk van de afzonderlijke compartimenten. Dat is aan de ene kant een kwestie van regeltechniek op parameters als pH (het begin van de dikke darm is zuur; verderop is de zuurgraad bijna neutraal) en transitietijd. En het regelmatig voeden van het systeem, net zoals dat bij een mens gaat. Dus drie keer per dag een representatief mengsel in het systeem brengen. Als het voedsel van de dunne darm naar de colon ascendens gaat, gebruiken de bacteriën daar als eerste de koolhydraten uit het voedsel. Die hebben namelijk een hogere energie-opbrengst en kunnen sneller worden omgezet dan eiwitten. Verderop in de darm raken die op en storten de bacteriën zich op de eiwitten. Deze processen hebben weer verschillende pH’s en retentietijden.

Lynn Verstrepen, project manager voor de host microbioom interacties bij ProDigest, maakt veel gebruik van de door BioSPPX geleverde Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader van Biotek.

 

Representatieve status quo

Het vergt ongeveer twee weken voeden voordat het microbioom vanuit het fecale monster stabiel is en qua samenstelling en activiteit voor de verschillende onderdelen van de SHIME® representatief is voor de in vivo situatie. Zodra deze status quo, die wekenlang behouden kan blijven, is bereikt kan feitelijk worden gestart met de experimenten. Een typisch voorbeeld uit de food wereld van zo’n experiment is het testen van prebiotica, waarbij wordt nagegaan wat de invloed is van een bepaalde vezel op de activiteit en samenstelling van het microbioom. In de tweewekelijkse controleperiode met het standaard dieet wordt regelmatig bemonsterd en wordt vanuit de analyse op basisparameters als korte-keten vetzuren, lactaat, gasproductie en ammoniumgehalte de metabole activiteit bepaald. Ook kan de analyse van de metagonomics en/of metabolomics worden gedaan. Vervolgens wordt bovenop het normale dieet de behandeling toegediend, waarna weer dezelfde parameters worden geanalyseerd en vergeleken met de nulwaardes. Met probiotica kan je hetzelfde doen, al moet je ook hier het probioticum zelf in de gaten houden: die moet immers levend het doelgebied bereiken om überhaupt enig effect te hebben.

 

Focus op darmslijmvlies

In de loop der tijd is het modulaire SHIME® platform uitgebreid met allerlei modules, geautomatiseerd en ook verder verfijnd. Een veelgebruikte module is de M-SHIME®, waarbij de M staat voor mucus, de darmslijmvlieslaag. Voeg je deze module toe aan de experimentele opstelling, dan kan je ook specifiek de bacteriën bestuderen die zich hechten aan deze laag. De M-SHIME® bestaat uit kunststof carriers waar een soort van slijmlaag die de darmwand nabootst op gecoat wordt. Door die in de dikke darm compartimenten te brengen, zullen bepaalde bacteriën daaraan hechten, en andere juist niet. De hechtende bacteriën vormen een barrière tegen ziekteverwekkers, door het induceren van mucosale immuunreacties en bezetten ook de plek die anders kan worden ingenomen door potentieel schadelijke kolonisatoren. De evaluatie van veranderingen in bacteriële adhesie als gevolg van bijvoorbeeld een prebiotische behandeling of het specifieke adhesievermogen van probiotische stammen is een cruciale stap om gastheermicrobiota interacties en de daaruit voortvloeiende gezondheidseffecten te bestuderen.

 

Kwantitatieve analyse

Om te kijken wat er zich afspeelt in het darmslijmvlies en het onderliggende darmgedeelte kan je grofweg twee dingen bestuderen. Ten eerste de samenstelling van zowel mucus als lumen, voor en na het experiment. Welke bacteriën zitten specifiek in de mucus; worden het er meer of minder, enzovoorts. De kwantitatieve compositie kan worden bepaald door middel van high-throughput sequencing, wat is uitbesteed bij een gespecialiseerde dienstverlener op dit gebied. “Ontwikkelingen in instrumentatie gaan zo snel, dat je dat als min of meer incidenteel gebruiker niet bij kunt houden. Als ik daarvoor een gespecialiseerde partner contacteer werk ik altijd met een topinstrument. Bovendien zijn de analysekosten dermate gedaald dat die niet opwegen tegen de investerings- en opleidingskosten voor ‘in house’ bepalingen. Dat geldt trouwens ook voor het metabolomics gedeelte, al wegen we hier wel steeds af wat we binnen ons analytisch lab kunnen doen en wat we uitbesteden. Afgelopen jaar wilden bijvoorbeeld enkele klanten de analyse van de verschillende aminozuren na toediening van een bepaalde component. Die bepaling hadden we nog niet, maar vonden we wel relevant om in huis te hebben. Dus ontwikkelden we hiervoor een HPLC-protocol. Maar als er een vraag komt naar een heel specifiek geneesmiddel, dan doen we die investering niet en besteden de analyse uit of laten het de klant zelf doen”, zegt Massimo Marzorati.

Pauline Lannoo, senior associate scientist, werkend in een anaerobe kast, een toestel dat gebuikt wordt om met zuurstofgevoelige darmbacteriën te werken.

 

De SHIME® in actie.

 

Efficiënt testen

Een tweede benadering voor het testen van de effecten van je experimenten zijn allerhande celassays. Dit gebeurt juist wel in house, en gaat steeds efficiënter dankzij de recente investering in een door BioSPX geleverde Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader van Biotek. Lynn Verstrepen, project manager voor de host microbioom interacties, beschrijft hoe dit instrument het testen vergemakkelijkt. “Je kunt de Cytation 5 beschouwen als een geautomatiseerde microscoop, die je kunt gebruiken om te controleren hoe je cellen er uitzien, maar ook voor bepaalde assays, zoals ‘wound healing’ assays waarbij je in de cel een wond aanbrengt en je bekijkt, als je een bepaald product toevoegt, hoe snel dat die wond terug kan sluiten. Dat is belangrijk bij onderzoek naar darmziektes, omdat daar ook de darmwand is aangetast. Als producten die wonden beter kunnen genezen is dat positief voor bijvoorbeeld de ziekte van Crohn of colloïtis. Wij gebruiken hiervoor 24-wells plaatjes, maar daar hebben we er heel veel van nodig voor een experiment. Voordien moesten we hiervoor handmatig een foto maken op verschillende tijden en die foto’s moest je ook nog eens handmatig verwerken om bijvoorbeeld de grootte van de laesies te meten.” “Het voordeel van de Cytation 5”, gaat zij verder, “is dat je de plaat er gewoon in kunt steken, zaken als autofocus, auto-exposure kunt instellen en vervolgens heel precies kunt aangeven waar die foto precies moet worden genomen. We hebben gekozen voor het uitgebreide softwarepakket, zodat we het instrument ook precies de dimensies van de laesie kunnen laten bepalen. Alle gemeten waarden komen in een excel-bestand, zodat je het verloop netjes in een grafiek kan volgen. Dat gebeurt allemaal volledig geautomatiseerd, zodat we zonder veel personele inspanning in korte tijd heel veel screenings kunnen doen.”

 

Aanjager voor nieuwe diensten

De Cytation 5 maakt in zekere zin ook de ontwikkeling van nieuwe diensten mogelijk. Het instrument kan namelijk ook Z-stacks opnemen, waarbij je beeld voor beeld een 3D-structuur kunt opbouwen. “We willen ook onderzoeken of bepaalde geneesmiddelen toxisch zijn voor de lever. Dat doen we door van de levercellen sferoïds te maken. Er is namelijk aangetoond dat wanner je je levercellen in een 3D-structuur kweekt ze veel meer enzymen tot expressie brengen die nodig zijn om geneesmiddelen om te zetten en zo een rol spelen bij de toxiciteit van bepaalde producten. Die assays worden nu gedaan op 96- well plaatjes. Voorheen moesten we van ieder welletje handmatig een foto maken om te vergelijken en zo de toxiciteit te bepalen. Nu kunnen we de sferoïds geautomatiseerd screenen, wat dus weer veel sneller gaat”, aldus Lynn. Een laatste voordeel dat de project manager wil aanstippen is dat je niet alleen brightfield opnames kunt doen, maar ook fluorescentie. “Voorlopig maken we gebruik van drie filters, waardoor we in het blauwe, rode en groene kanaal kunnen meten. Dat is handig voor darmonderzoek, om te kijken of het darmepitheel sterke tight-junctions heeft. Nu doen we dat met qPCR en het meten van de elektrische weerstand in trans-welletjes. Maar we kunnen dat ook zichtbaar maken door de betrokken eiwitten te gaan aankleuren en te bekijken of ze sterker of zwakker tot expressie komen, al dan niet samenklonteren aan de zijwand. Zo kan je bijna letterlijk ziet wat er gebeurt en krijgt de klant niet alleen informatie over het effect, maar ook inzicht in het waarom!”

 

INFORMATIE

 

BioSPX

www.biospx.com

 

ProDigest

www.prodigest.eu