KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 35, MEI 2018

Arthrogen hard op weg met gentherapie tegen artritis

Het op het AMC-terrein gevestigde biotechbedrijf Arthrogen is onlangs een Fase Ib-klinische studie gestart met ART-I02 voor de intra-articulaire behandeling van bepaalde vormen van artritis. De studie zal met argusogen door de markt worden gevolgd, want in tegenstelling tot bij andere gentherapieën, die zijn ontwikkeld voor hele zeldzame ziektes, is er hier sprake van een groep ziektebeelden met een veel grotere incidentie.

Ingrid de Vries, senior technician vector development bij Arthrogen, werkt sinds vorig jaar met de door Greiner Bio-One ontwikkelde CELLdisc, een vier- of achtlagige stack van platen. Hiermee realiseert ze een forse tijdsbesparing ten opzichte van het werken met losse schaaltjes. Er zijn ook stacks met zestien en veertig lagen.

Om en nabij de één tot twee procent van de Nederlands bevolking krijgt reumatoïde artritis. Patiënten met deze auto-immuunziekte kunnen in veel gevallen succesvol worden behandeld met ontstekingsremmers en -als ze daar niet goed op reageren– met moderne biologicals, antilichamen die systemisch op specifieke targets in de ontstekingspathways werken. Echter, niet iedereen is bij die middelen gebaat. Dat constateerde –meer dan tien jaar geleden al– professor Paul-Peter Tak, die toentertijd als reumatoloog bij het AMC werkte. Hem vielen twee zaken op. Ook al waren er gewrichten die goed reageerden, waar de inflammatie minder werd, zwellingen afnamen en de beweeglijkheid toenam, toch hadden veel patiënten enkele gewrichten die wel die ontstekingskenmerken vertoonden. Bovendien ondervonden vele patiënten allerlei bijwerkingen, die het gevolg waren van de systemische werking van de geneesmiddelen. “Deze observaties brachten hem tot het idee om iets te ontwikkelen dat lokaal kan worden toegediend en daar ook zijn werk doet, en dan het liefst ook nog door een eenmalige behandeling. Gentherapie vormde hiervoor een uitstekende benadering. Op basis hiervan zou je een virus kunnen gebruiken om in de synoviale cellen van het ontstoken gewricht een stukje DNA af te leveren dat getriggerd door de ontsteking een anti-inflammatoir eiwit opreguleert, dat op zijn beurt de ontsteking tegengaat. Dit idee, dat aan de basis stond van de oprichting in 2005 van Arthrogen door het AMC en het Dubai Bone & Joint Center, is na twaalf jaar hard werken uitgemond in ART-I02, dat momenteel voor het eerst bij mensen met RA (reumatoïde artritis) en OA (osteoartritis) wordt getest in het kader van een Fase Ib-klinische studie, zowel in Nederland als in Canada”, zegt Robert Jan Lamers, die sinds ruim drie jaar CEO van het biotechbedrijf is.

 

Vooruitstrevend

Het idee van een lokale gentherapie met een aan-uit knop was –zeker voor die tijd– behoorlijk vooruitstrevend. Je kunt je wel voorstellen hoe dat in zijn werk zou kunnen gaan, maar zie het maar eens te realiseren. Dat wil zeggen: zorg er voor dat in alle stappen binnen dat therapeutisch mechanisme gebeurt wat er moet gebeuren. En zoek daarbij ook nog eens uit welke vectoren, targets, promotors en therapeutische eiwitten zich daar binnen dat complexe product het beste voor lenen. Bij ART-I02 is die ontwikkeltocht uitgemond in het gebruik van een adeno-geassocieerd virus (rAAV) type 5 om het therapeutisch gen in de gewrichtscellen af te leveren. Er is gekozen voor type 5 omdat dat serotype goed gewrichtscellen kan induceren. Het therapeutisch gen codeert voor het humaan interferon-β (hIFN-β) eiwit dat de ontsteking te lijf gaat. De transcriptie van het mRNA van dit hIFN-β wordt gecontroleerd door een ontstekings- induceerbare promoter, de nucleaire factor (NF)-κB-responsieve promoter, die ook in het genetisch construct is ingebouwd. Het therapeutische effect komt als volgt tot stand. Door injectie van ART-I02 in het gewricht krijgen de gewrichtscellen extra genetische informatie voor de expressie van het gen en de aanmaak van het humaan interferon-β. Als er geen sprake is van een ontsteking, gebeurt er niets. Als er zich een ontsteking gaat ontwikkelen (of als die er al is) zal de promoter de aanmaak van het humaan interferon-β in gang zetten. Dit eiwit heeft in diermodellen voor reumatoïde artritis een anti-inflammatoire werking laten zien. Verder speelt het een belangrijke rol bij het behoud van bothomeostase en blijkt het anti-angiogene eigenschappen te hebben, wat weer van therapeutische waarde bij RA is. Met proof-of-principle-onderzoeken heeft Arthrogen aangetoond dat er verbetering optreedt na gentherapie in artritis diermodellen door de plaatselijke expressie van IFN-β in de gewrichten. Interferon-β behandeling beschermde tegen klinische tekenen van artritis, ontsteking in het gewricht en erosie van botten en kraakbeen. Naast de aan-uit knop is ook het langdurige effect een sterke troef van dit nieuw in ontwikkeling zijnde medicijn. Omdat er in de synoviale cellen in tegenstelling tot bijvoorbeeld bloed- en huidcellen een hele lage omloopsnelheid is, zal het vreemde DNA niet snel worden opgeruimd en zullen de cellen als ze delen de mutatie doorgeven. In theorie zou je dan met een eenmalige injectie kunnen volstaan.

‘The place to be’ bij Arthrogen is het ML-II viruslab waar volgens een
in de loop der jaren door het team geoptimaliseerd protocol de
gemodificeerde virussen worden geproduceerd.

 

Meer labruimte

Het gros van het experimentele werk alsmede de productie van de research batches wordt uitgevoerd door een team van vijf technicians, die onder leiding staan van een supervisor. Daarnaast zijn er twee voor het werken met proefdieren bevoegde technicians die in de proefdierfaciliteit van het AMC het benodigde dierexperimentele werk uitvoeren. De laboratoria zijn momenteel nog verdeeld over twee locaties. In het bedrijfsgebouw is het ML-II viruslab te vinden. Hier worden de virussen ontwikkeld en geproduceerd. Het meer voorbereidende werk, zoals het kweken van bacteriën voor het vermeerderen van plasmides, vindt plaats in enkele ML-I-laboratoria, die net buiten het gebouw in een portacabin zijn ondergebracht. “Met deze tijdelijke huisvesting, waar we inmiddels al een jaar of acht gebruik van maken, konden we destijds onze behoefte aan meer labruimte invullen zonder te hoeven verhuizen vanaf deze prima plek, zo dichtbij het AMC. Door de groei van ons bedrijf blijft die behoefte echter toenemen. Gelukkig is er onlangs binnen het gebouw een kantoorvleugel op de eerste verdieping voor ons beschikbaar gekomen, waar we na een verbouwing meer kantoren en ook extra labruimte kunnen realiseren. De portacabins gaan dan weg”, vertelt Ingrid de Vries, senior technician vector development, die al bijna tien jaar bij Arthrogen werkt.

 

Tijdwinst bij transfectie

Ingrid is de meest tijd te vinden in het viruslab, waar ze volgens een in de loop der jaren door het team geoptimaliseerd protocol de gemodificeerde virussen produceert. Dit gebeurt door middel van plasmide transfectie op zoogdiercellen, waarbij in die cellen het virus met het plasmide wordt gemaakt. Dit was aanvankelijk een vrij bewerkelijke stap, omdat hiervoor losse petrischaaltjes van 15 cm doorsnede werden gebruikt. “Voor een gemiddelde productie gebruikten we 40 van die schaaltjes, waarbij je stuk voor stuk de cellen aan het oppervlak liet hechten, er een transfectiemedium opbracht en enkele dagen liet incuberen om het virus te maken om het vervolgens te oogsten. Sinds afgelopen jaar gebruiken we hiervoor de door Greiner Bio-One ontwikkelde CELLdisc, in ons geval een vier- of achtlagige stack van platen met een doorsnede van 20 cm. Het voordeel van deze oplossing is dat je niet meer elke disc apart hoeft te behandelen. Met de CELLdisc kan je volstaan met het maken van een grote mix, die je via een opening bovenop toedient. Op die manier vul je in één keer vier of acht lagen. Na afsluiten van de opening kan je het medium gelijkmatig over alle lagen verspreiden door hem op een bepaalde manier te roteren. Daarna kan je hem gewoon rechtop in de incubator zetten. Ook als je moet oogsten is dat veel gemakkelijker: je maakt de opening weer los en je kunt alles er in één keer uithalen. Als je de incubatietijd even buiten beschouwing laat hebben we nu binnen drie kwartier de hele transfectiemethode afgerond; dat kostte ons eerder een paar uur”, vertelt Ingrid.

 

Wel de volle, niet de lege

Na het oogsten is het zaak om het gemodificeerde virus te isoleren. Dat is in principe uitgescheiden in het medium, maar er kan ook nog virus in de cellen zijn achtergebleven. Hiertoe worden de cellen enkele uren geïncubeerd in een NaCl-oplossing. Na afdraaien wordt het supernatant verder verwerkt; de celresten blijven achter in het celpellet. “Het volume van het supernatant waar het virus in zit is groot, ongeveer 800 ml. We concentreren derhalve eerst het supernatant met een TFF, een ‘tangential flow filtration’ systeem naar ongeveer 80 ml. Dat volume brengen we op een affiniteitskolom, waar het virus aan bindt. Met een elutiebuffer haal je het virus weer van de kolom, zodat je het in een zuivere vorm hebt. Echter, je hebt dan een mengsel van volle (partikels die het genconstruct bevatten) en lege partikels van het virus. Om die van elkaar te scheiden voeren we een zogenaamde cesiumchloride centrifugatie uit. Het virus dat van de affiniteitskolom is afgekomen wordt in een cesiumchloride-oplossing gebracht, die gedurende 24 uur gecentrifugeerd wordt bij 30.000 rpm. Er zit geen rem op het systeem, zodat je nadat de centrifuge is uitgelopen met behulp van een lichtbron een mooie virusband kunt detecteren.
Omdat de lege virussen net ietsje hoger zitten dan de gevulde kan je met een injectienaald precies de virusdeeltjes met inhoud isoleren”, vertelt Ingrid. Dan ben je er nog niet, want je moet het virus nog in de juiste formuleringsbuffer brengen. Hiervoor gebruiken we een specifiek centrifugefilter waarbij het virus op het filter achterblijft terwijl het cesiumchloride er doorheen gaat. Op deze manier verwijderen we het cesiumchloride en vervangen we dit door de formuleringsbuffer. Uiteindelijk wordt het virus met behulp van dit filter geconcentreerd en steriel afgevuld. Het gezuiverde virus wordt dan nog aan een aantal testen onderworpen, ondermeer op de aanwezigheid van endotoxines; de titer van het virus wordt bepaald, alsmede het percentage volle partikels. Tenslotte wordt er nog een test gedaan op de cellen om te bevestigen dat het virus ook het therapeutisch eiwit maakt.

 



CEO Robert Jan Lamers merkt veel belangstelling voor de gentherapeutische behandeling van artritis
met ART-I02. Onlangs is met een two-center study een Fase Ib-klinische studie gestart.
In Leiden worden patiënten in hun handgewrichten geïnjecteerd; in Canada in de pols.

 

Afwisselend en zelfstandig

Al met al is de doorlooptijd voor het maken van een gemodificeerd virus zo’n zes tot acht weken. “Zo voelt dat echter niet als je in het lab aan het werk bent. Het werk is heel afwisselend; de ene keer verricht je wat handelingen voor de virusproductie en tijdens incubatie- of centrifugeerstappen werk je weer aan een ander researchproject. We hebben hier heel veel vrijheid om je tijd zelf in te delen en kunnen onze eigen invulling geven aan projecten, mogen dingen bedenken. Natuurlijk wordt er wel een en ander gestroomlijnd in het wekelijks overleg. Ook hebben we iedere drie weken een research meeting waarin collega’s hun vorderingen presenteren. Dat is heel inspirerend, zeker in de fase waarin we nu zitten, waarin we richting klinische trials gaan.”

De technicians worden ook in die nieuwe fase van het bedrijf nadrukkelijk bij de business betrokken. Zo maakt Ingrid samen met haar supervisor Sabine van der Sanden en COO Janneke Meulenberg deel uit van een projectgroep voor de opzet en uitwerking van de Fase 2-klinische studie. “Met de huidige methode voor het produceren van de virussen kom je tot research batches; veel te weinig voor de hoeveelheden die je nodig hebt voor Fase 2-klinische studies (en nog verder voor Fase 3 en de markt). Omdat die productie ook nog eens onder GMP moet plaatsvinden, ligt samenwerking met een CMO voor de hand. We hebben derhalve verschillende CMO’s benaderd om te kijken wat ze ons kunnen bieden. Naast de bedrijfsmatige kant kijken we ook met een praktisch oog: hoe werken ze, hoe ziet hun proces eruit. Daar zit ook weer veel labwerk aan vast, want je wil toch in detail testen of optie A beter werkt dan optie B. Dat is best wel spannend, want je komt nu toch in een hele nieuwe fase; het gaat meer om het ‘eggie’!”, lacht Ingrid de Vries.



Arthrogen is gevestigd op de begane grond van dit pal naast het AMC gelegen gebouw.
Binnenkort zal ook een gedeelte van de eerste verdieping worden betrokken.

 

Doorontwikkelen

Naast het werk voor productie gaat de pre-klinische ontwikkeling nog volop door, op meerdere fronten. Robert Jan Lamers: “We blijven doorontwikkelen op ieder deeltje van ons product; kijken naar nieuwe vectoren, werken aan de promoter en het therapeutisch gen. Ook kijken we naar de verschillende vormen van artritis en aanpalende ziektebeelden, waarvoor je wellicht specifieke gentherapieën kunt ontwikkelen. We hopen bij de start van Fase 2 een tweede product in een studie te krijgen. Dat kan voor een net iets ander ziektebeeld zijn, of met een net iets andere promoter, of een net iets ander therapeutisch gen. Kansen genoeg wat dat betreft...”

 

Greiner Bio-One

www.gbo.com

 

Arthrogen

www.arthrogen.nl