KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 34, MAART 2018

Cryo-opslag van Bioversity in Leuven

is veilige haven voor alle bananensoorten

Bioversity International heeft aan de KU Leuven materiaal van alle bekende banananvariëteiten opgeslagen. Naast een bijna complete in vitro werkcollectie zijn er inmiddels al ruim duizend soorten in de cryocollectie opgenomen. Het is de ambitie van biobankbeheerder en cryopreservatiepionier Bart Panis om ook die cryocollectie compleet te maken. Bovendien wil hij de onlangs verbeterde en uitgebreide cryofaciliteiten voor andere gewassen beschikbaar stellen.

 

Bart Panis heeft bij de Bioversity-vestiging in Leuven onlangs in samenwerking met Cryo Solutions de cryo-installatie volledig gemoderniseerd.

Alle bananen die je in de supermarkt of bij de groenteboer koopt, of ze nu van één van de bekende merken zijn of een ‘fair trade’ en/of biologisch keurmerk hebben, zijn van een en hetzelfde soort, de cultivar Cavendish. Dat heeft alles te maken met de resistentie van de Cavendish-banaan tegen de de door een bodemschimmel veroorzaakte panamaziekte, die in de vorige eeuw het tot dan toe voor de export geteelde Gros Michel-ras in Zuid- Amerika wegvaagde. Omdat de schimmel ook op andere continenten huis begon te houden is sindsdien de Cavendish aan een enorme opmars begonnen, uitmondend in een allesoverheersend aandeel in de huidige bananenteelt.

“Het cynische is dat de redder in nood van weleer dezelfde achilleshiel heeft als de Gros Michel, want in 1992 werd een Fusarium-stam ontdekte die de Cavendish-banaan wel aantast, de Tropical Race 4 (TR4). Die schimmel heeft zich de afgelopen jaren kunnen verspreiden in Zuidoost Azië en is recent ook opgedoken in delen van Afrika. Als westerling kan je daarbij je schouders ophalen (de supermarkt wordt toch wel gevuld, is het niet rechtsom, dan toch zeker linksom), maar voor de lokale bevolking kan dat leiden tot een regelrechte ramp. Bananen zijn daar het basisvoedsel voor miljoenen mensen, wat ook is af te leiden uit het gegeven dat wereldwijd gezien 85 procent van de geteelde bananen wordt verhandeld op lokale markten, terwijl slechts 15% wordt geëxporteerd. Als je daarbij meeneemt dat 80 tot 90% van de mensen in ontwikkelingslanden afhankelijk is van de landbouw, die veelal gericht is op maar enkele gewassen, dan is een gezond bananenras echt een kwestie van leven of dood. Wij als Bioversity International willen die afhankelijkheid verminderen door de biodiversiteit van bananen beschikbaar te stellen en te behouden, voor huidige en voor volgende generaties”, stelt Bart Panis, senior onderzoeker bij de wereldwijde onderzoeksorganisatie voor het behoud en gebruik van agrobiodiversiteit.

 

Werkcollectie

Het behouden van biodiversiteit van bananen is om verschillende redenen belangrijk. Naast het verminderen van de kwetsbaarheid van monoculturen voor ziektes geldt dat er onder de circa 1.500 verschillende soorten zeker 600 tot 700 verschillende eetbare bananensoorten zijn. Daar zitten soorten tussen met veel vitamines en weer anderen kunnen een goede resistentie hebben tegen ziektes. Die genetische diversiteit kan je dan weer toepassen in veredelingsprogramma’s. Verder kunnen soorten verloren gaan door klimaatverandering, oorlog en natuurrampen. Bij de meeste gewassen wordt de diversiteit bewaard in grote zaadcollecties. Hierbij wordt het gedroogde zaad bewaard bij -20 °C, een methode die afhankelijk van de plantensoort goed is voor een houdbaarheid van tenminste 20 tot meer dan 100 jaar. Fameus wat dat betreft is de wereldzadenbank op Spitsbergen, waar in een verlaten kolenmijn, 120 meter diep in een berg, talloze zaden van duizenden planten en gewassen ➞ veilig zijn opgeslagen. Momenteel gaat dat om een kleine 900.000 zaadpartijen.

 

 

De cryo-installatie is uitgebreid met twee tanks voor 4.800 cryotubes en twee voor 30.000 tubes, alsmede een drukvat dat zorgt voor de automatische vulling van de opslagtanks.

Deze wijze van bewaren is voor de banaan geen optie, omdat eetbare bananen –zo’n beetje de helft van het aantal bekende soorten– geen zaad vormen. “Je kunt dan overwegen om veldcollecties te maken, maar ook hier ben je weer kwetsbaar voor ziektes, stormen, molest, noem maar op. Wij hebben derhalve een in vitro collectie opgezet, waarbij je de planten laat opgroeien in proefbuisjes. Dit is met 1.500 verschillende soorten een nagenoeg complete collectie. Een collectie die veel onderhoud vergt, want gemiddeld een keer per jaar moeten de planten worden overgeënt omdat ze anders te groot worden. Dat enten gebeurt vanuit kleine, totipotente stukjes, een soort begin van scheutjes. Die worden steriel gemaakt en op een in vitro medium gezet, dat bestaat uit water, suikers, vitamines, mineralen; alle stoffen die een plant nodig heeft om te groeien. De suikers zitten er in omdat die kleine plantjes niet aan fotosynthese kunnen doen. Dus je moet daar een energiebron aan toevoegen. En er moet steriel worden gewerkt, omdat een medium met suikers ook ideaal is voor schimmels en bacteriën. Ze worden bewaard in een koude kamer bij 15 °C om de groei te vertragen, maar dat neemt niet weg dat ze dus ieder jaar moeten worden overgeënt, waarbij je de hele procedure opnieuw moet doorlopen. Dat gebeurt ook als onderzoekers materiaal opvragen. Je moet immers eerst vermeerderen voordat je iets weggeeft, anders ben je zo door je voorraad heen. Wat dat betreft is het een echte werkcollectie”, vertelt Bart Panis.

 

Cryopreservatie

Om gewassen nog langer, voor honderden jaren, te bewaren is cryopreservatie de ideale techniek, omdat je hiermee de groei volledig kan stopzetten. Dat is in het geval van de banaan niet zo eenvoudig. “Banaan is een tropische plant, die veel water bevat dat bij het invriezen kan leiden tot de vorming van ijskristallen, wat schadelijk is voor de cellen. Om dat te vermijden hebben we de druppelvitrificatie methode ontwikkeld. Die passen we toe op het meristeem van de banaan, deeltjes van de scheut met totipotente cellen, niet groter dan enkele honderden micrometers, die we heel omzichtig uit de in vitro plantjes van de werkcollectie snijden. Met behulp van een cryoprotectieve oplossing die bestaat uit glycerol, ethyleenglycol, DMSO en suiker kunnen we de cellen osmotisch dehydrateren, zodat er minder water in de cel overblijft. Bij onderdompeling in vloeibare stikstof treedt dan geen kristalvorming op, maar een glastransitie. Truc daarbij is dat je heel snel invriest en ook weer heel snel ontdooit.”

 

Bewerkelijk

Bart Panis en zijn collega’s ontwikkelden al in 2001 de druppelvitrificatie methode voor banaan. Sindsdien staat het robuuste protocol aan de basis van soortgelijke methoden voor onder andere aardappel, cassava en look. De expertise van de Leuvense wetenschappers wordt ook structureel ingezet voor kennisoverdracht en training op dit gebied. Ondanks de jarenlange ervaring blijft het een zeer arbeidsintensief proces.

“Je moet eerst in vitro plantjes maken. Uit elk in vitro plantje kan één meristeempje onder de microscoop worden uitgesneden. Voor een representatieve procedure gebruiken we 180 meristemen. Het lukt op een dag om 60 meristemen uit te snijden, die dan in de namiddag worden ingevroren. Dat doen we dus drie keer om er zeker van te zijn dat die introductie veilig is bewaard. Van al die ingevroren meristemen ontdooien we na korte tijd ongeveer 30% om te checken of het protocol heeft gewerkt, dat wil zeggen of je er plantjes uit kunt laten groeien. Daar kun je beter direct achterkomen in plaats van over zeg honderd jaar! Die controle doe je omdat je met biologisch materiaal nooit alles 100% onder controle hebt. Het is mensenwerk, ook voor de goed opgeleide en ervaren persoon die met al zijn kennis en kunde maximaal 50 soorten per jaar kan invriezen. Dat betekent ook dat het een duur proces is, waarbij we voor de voortgang in belangrijke mate afhankelijk zijn van externe financiering. Dat maakt dat het ook een kwestie van lange adem is: in ruim vijftien jaar hebben we nu 1.050 introducties ingevroren onder vloeibaar stikstof, dus we hebben nog even te gaan”, aldus Bart Panis.

De in vitro werkcollectie dekt met 1.500 verschillende soorten nagenoeg de complete diversiteit van bananenplanten, met van elk soort 20 plantjes.

Zelfs ervaren laboratoriummedewerkers kunnen maximaal 50 bananensoorten per jaar invriezen.

 

Upgrade cryo-opslag

Onlangs is de cryo-opslag in Leuven volledig vernieuwd en uitgebreid. Aanvankelijk was de opslag verdeeld over vijf kleine tanks met elk 4.800 cryotubes van 2 ml, waarbij in elke tube tien meristemen kunnen worden bewaard. “Toen we aan zagen komen dat de opslagcapaciteit volledig benut zou raken, zijn we niet alleen gaan nadenken over uitbreiding van de capaciteit, maar ook over een verdere professionalisering van de cryo-installatie, met name op het gebied van beveiliging en kwaliteitscontrole. Het controleren van de stikstofniveaus en het automatisch bijvullen van stikstof moet altijd goed gaan, want het materiaal mag absoluut niet ontdooien, want dan is het waardeloos. We willen wat dat betreft geen enkel risico nemen. Hiervoor hebben we met Cryo Solutions een oplossing uitgedacht, waarbij we de capaciteit hebben uitgebreid met nog twee kleine tanks, een druktank en twee grote tanks, die elk 30.000 tubes kunnen bevatten. Die tanks worden vanuit de druktank automatisch gevuld. Vooralsnog wordt de druktank zelf nog handmatig gevuld vanuit de grote opslagtank buiten het gebouw, omdat de afstand tot de opslag te groot is om daarvoor een leiding aan te leggen.

Echter, nog uit te voeren plannen voor een verbouwing maken dat die opslagtank dichterbij kan worden geplaatst, en dan is er wat de stikstofvoorziening betreft helemaal een ideale, geautomatiseerde situatie”, vertelt Bart Panis. De tanks zijn ook uitgerust met het Xiltrix monitoring- en alarmeringssysteem, dat gekoppeld is aan het centrale alarmsysteem van de KU Leuven. Dat levert de gebruiker veel meer informatie dan in de oude situatie: “Aanvankelijk kregen we alleen de melding ‘er is iets’. Nu kunnen we op afstand zien wat er precies aan de hand is, hoe hoog het stikstofniveau is.”

 

Ook voor derden

Met de uitbreiding is er meer dan voldoende capaciteit om een backup te maken van al het materiaal dat reeds gecryopreserveerd is alsmede de meristemen van bananensoorten die de komende tien jaar met de druppelvitrificatie methode zullen worden ingevroren. Die extra ruimte kan ook worden benut voor opslag van bevroren plantenmateriaal uit andere collecties. “We willen een soort verzekering zijn voor andere instituten die met cryopreservatie bezig zijn. De meesten hebben de cryo- en de in vitro collectie in hetzelfde gebouw. Dat geldt overigens ook voor ons zelf, vandaar dat we een deel van het ingevroren materiaal laten bewaren in een cryofaciliteit in Montpellier. Maar wij hebben nu de capaciteit en de benodigde beveiliging om een soort Spitsbergen te zijn voor bijvoorbeeld de aardappelcollectie in Peru, de cassavecollectie in Colombia en de lookcollectie in Zuid-Korea. Ook daarin is het Xiltrix-systeem van toegevoegde waarde, want we kunnen naast monitoring ook de hele historie opslaan en oproepen van alle essentiële parameters. Hiermee kunnen we kwaliteitmanagementsystemen voeden van zowel ons eigen als andere instituten. Wat dat betreft zijn we helemaal klaar om materiaal te ontvangen!”

 

Cryo Solutions

www.cryosolutions.nl

 

Bioversity International

www.bioversityinternational.org