EDITIE 33, SEPTEMBER 2017

Breed-spectrum testen op HPV

levert meerwaarde op

voor de pathologie bij PAMM

Met het centraliseren van het vanuit het bevolkingsonderzoek naar baarmoederhalskanker testen op HPV-infectie, is veel HPV-werk weggevallen bij de perifere laboratoria. Omdat de gynaecologen hun patiënten steeds vaker op HPV laten testen, is die terugval meer dan gecompenseerd.
Bij PAMM (laboratoria voor pathologie en medische microbiologie) maakt men gebruik van een breed-spectrum HPV-test. Die geeft een gedifferentieerd beeld van zowel de high-risk HPV’s als de low-risk virussen.

 

 

 

 

 

 

Klinisch moleculair bioloog in de pathologie Judith Jeuken kan bij PAMM vanaf ieder beeldscherm de resultaten van de PapilloCheck test van Greiner Bio-One oproepen, waarmee 18 high-risk en 6 low-risk HPV varianten kunnen worden vastgesteld.

Eerst zien, dan geloven. Zo zou je de werkwijze kunnen samenvatten waarin de patholoog en moleculair bioloog in het laboratorium voor Pathologie bij PAMM in Eindhoven gezamenlijk tot een optimale diagnose komen. Het zien gebeurt door de pathologen, vooral door de microscoop, waarbij gekeken wordt naar weefsels en cellen en specifieke kleuringen op die cellen.

Zien zij bepaalde afwijkingen en willen zij hun vermoeden van diagnose bevestigd zien, of is er aanvullende informatie nodig, dan gaat de moleculair bioloog aan de slag met technieken die iets zeggen over het DNA dat in die cellen zit. “De volgorde is hierbij altijd hetzelfde. De patholoog neemt het voortouw, en kan in veel gevallen ook zonder onze inbreng zijn of haar diagnose stellen. Maar is er aanvullende informatie nodig voor het vaststellen van de diagnose, prognose of therapie, dan wordt ook gebruik gemaakt van de moleculair biologische expertise”, vertelt Judith Jeuken, sinds 2011 werkzaam bij PAMM als klinisch moleculair bioloog in de pathologie. Zij is met haar moleculair-biologische achtergrond overigens nog ver in de minderheid ten opzichte van de medisch geschoolde pathologen bij pathologie: één om zestien. “Maar zo voelt dat absoluut niet! Sowieso hebben twee pathologen moleculaire diagnostiek als aandachtsveld, en ze zijn in die hoedanigheid mijn sparringpartners. Ook de andere pathologen hebben vanuit de praktijk uitgebreide ervaring met de moleculaire diagnostiek, aangezien ze het allemaal aanvragen voor de door hen te beoordelen samples en de uitslagen verwerken in hun uitslagen.” Het is juist deze klinische relevantie die Judith Jeuken altijd heel erg heeft aangetrokken en de belangrijkste reden was voor haar overstap naar PAMM. Dit na vijftien jaar onderzoek bij het Radboud UMC, waar ze onder meer de onderzoekslijn moleculaire karakterisering en diagnostiek van (oligodendro)gliale hersentumoren heeft opgezet en uitgebouwd.

 

Moleculaire diagnostiek

Het DNA-werk kan worden onderverdeeld tussen de ‘glaasjes’ en de ‘epjes’. De ‘glaasjes’ staan voor FISH; fl uorescentie in-situ hybridisatie, waarbij je onder een fl uorescentiemicroscoop kijkt naar aangekleurde chromosoomdelen. Dat aankleuren gebeurt aan de hand van probes, van fl uorochromen voorziene stukjes enkelstrengs DNA die complementair zijn aan het stukje DNA van interesse in de cel. Afwijkingen in het normaal te verwachten aankleuringspatroon zijn karakteristiek voor een bepaalde pathologie. FISH wordt veel gebruikt voor karakterisering van bepaalde kankercellen op basis waarvan bepaald wordt of een patiënt in aanmerking komt voor een specifieke therapie. Zo komen patiënten met een Her2/neupositief mammacarcinoom vaak in aanmerking voor een behandeling met trastuzumab. Iedere nieuwe targetted-therapie brengt eigenlijk wel een nieuwe moleculaire test met zich mee. Dat kan een FISH-test zijn, maar in de meeste gevallen gaat het dan om een PCR-test, waar de ‘epjes’ voor staan. “De ontwikkelingen op dit gebied gaan echt razendsnel. Waar we in 2015 voor Nederland het eerste perifere centrum waren dat overstapte op ‘next generation sequencing’ (NGS) voor diagnostiek, dienen zich nu al weer nieuwe generaties apparatuur aan. We gebruiken NGS vooral voor tumordiagnostiek, en dus ook bij targetted-therapie, waarbij aan de hand van de gevonden mutatie een behandelplan voor individuele patiënten kan worden vastgesteld. Waar we eerder per fragment van interesse een test in tweevoud moesten inzetten, zet je bij NGS maar één test in, waarmee je van heel veel verschillende stukjes DNA in parallel de volgorde kunt bepalen en dan ook nog in 500- tot meer dan 1000-voud. Bij de test die wij momenteel uitvoeren gaat het om 92 fragmenten, dus 92 verschillende stukjes DNA. Dat is ruim, want de artsen in de ziekenhuizen die wij bedienen, hebben momenteel genoeg aan twaalf fragmenten die onderdeel uitmaken van vijf verschillende genen. We kunnen naar meer kijken, maar dat levert op dit moment alleen mutaties op, waar ze verder nog niets mee kunnen doen. Daarom hebben we er voor gekozen om alleen data te analyseren en te rapporteren die voor de behandeling relevant zijn. Als de patholoog of arts meer wil weten, dan openen we de datafile en extraheren de rest van de data voor rapportage”, vertelt Judith.

 

Dringen op de chip

Er worden steeds nieuwe mutaties ontdekt en iedere nieuwe targettedtherapie komt met een nieuwe moleculaire test. Fragmenten om die nieuwe mutaties te analyseren kunnen worden toegevoegd aan de bestaande set. Daar zit wel een pragmatische begrenzing in: “Je wilt die set niet oneindig groot hebben, want op de chip waarop de run wordt uitgevoerd, kunnen maar een beperkt aantal fragmenten worden gelezen. Als ik dat aantal veel groter maak, kunnen er bijvoorbeeld monsters van maar twee patiënten op een chip, terwijl dat er nu zes zijn. Dat maakt de analyse per patiënt direct een stuk duurder. Je kunt er ook voor kiezen om dan meerdere testen te laten lopen, maar dat maakt alles weer een stuk complexer.” Kostenefficiëntie heeft ook invloed op de doorlooptijd, maar is daarin niet allesbepalend. “Wij runnen twee keer in de week. Qua efficiency heeft één keer per week inzetten de voorkeur, maar dan moeten patiënten te lang wachten op de uitslag. Dit type tumordiagnostiek is vrij acuut; de patiënt is echt aan het wachten op de uitslag om de meest geschikte therapie te kunnen starten. In overleg met de kliniek kom je dan uit op een hogere testfrequentie”, zegt Judith.

In het laboratorium voor Pathologie bij PAMM in Eindhoven vinden in
het kader van de cytologische en histologische bepalingen veel kleuringen plaats.

 

Niet minder, maar meer HPV testen

Minder acuut, maar daarom niet minder belangrijk, zijn de PCR-testen voor het detecteren van bepaalde typen van het HPV-virus in uitstrijkjes. Ontwikkelingen in de aanpak van het bevolkingsonderzoek (BVO) naar baarmoederhalskanker, en de manier waarop gynaecologen tegen deze test aankijken hebben enerzijds een negatieve en anderzijds een positieve invloed gehad op het aantal HPV-testen dat bij PAMM wordt uitgevoerd. “Bij het BVO nieuwe stijl wordt standaard bij ieder uitstrijkje met een test gekeken of er sprake is van een HPV-infectie. Is dat het geval, dan gaan ze pas kijken of er afwijkende cellen zijn. Is dat het geval, dan volgt in een aantal gevallen doorverwijzing naar de gynaecoloog of een vervroegd herhaaluitstrijkje. Dit levert heel wat extra testwerk op, maar omwille van kostenefficiëntie is dat werk voor Nederland in vijf locaties gecentraliseerd, zodat voor het gros van de periferie, waaronder wij, al die BVO-testen zijn weggevallen. Dit geldt ook voor het werk van de analisten bij cytologie, die eerder van alle BVO-uitstrijkjes de cellen bekeken. Wij hebben hierop geanticipeerd door de analisten ook voor andere taken in te zetten, zoals het assisteren bij puncties. Punctiemonsters werden eerder pas in het lab beoordeeld op representativiteit. Was dat niet het geval, dan moest er weer een afspraak worden gemaakt voor een nieuwe punctie. Nu kijken analisten op locatie direct naar het preparaat en stellen vast of er voldoende cellen zijn voor een representatieve diagnose en kunnen ze meteen aangeven of er opnieuw moet worden geprikt”, vertelt Judith. Min of meer parallel aan de ontwikkelingen rond het BVO zijn ook de richtlijnen van de Nederlandse Gynaecologen Vereniging (NVOG), veranderd. Als HPV zo belangrijk is, dan moet in de uitstrijkjes die gynaecologen bij hun patiënten maken ook meer naar HPV worden gekeken zo is de gedachte. Dat levert PAMM veel extra aanvragen voor HPV-diagnostiek. Naar schatting zo’n 4.000 per jaar, een bijna verdrievoudiging ten opzichte van enkele jaren geleden.

 

Een brede blik op HPV

De voor het BVO gebruikte, meer algemene testen zeggen alleen of de gevonden HPV-variant high-risk positief of negatief is, en beperken zich daarbij doorgaans tot de HPV-16 en -18 varianten, die het meest indicatief zijn voor de ontwikkeling van tumoren. Maar daarbij doe je je volgens Judith als diagnostisch centrum tekort. “Uit het scala van HPV-varianten is nog veel meer relevante diagnostische informatie te halen. In de eerste plaats gaat het niet altijd om uitstrijkjes. We testen bij pathologie ook veel op weefsel dat in formaline is gefixeerd en in een paraffineblok is verwerkt. Het DNA dat je daar uit haalt bestaat echter niet meer uit mooie lange ketens, maar uit kortere fragmentjes. Ook dat materiaal willen wij kunnen analyseren met onze HPV-test. Bijvoorbeeld voor cervix-tumoren; daarvan willen ze ook weten of er HPV-16 of -18 inzit. Dat kun je met een PCR doen, maar als je zo’n klein fragment DNA hebt, kun je dat niet zomaar gaan PCR-en. Daarvoor is een kort PCR-fragmentje nodig, zodat ik dat paraffine-DNA ook betrouwbaar kan analyseren. In de tweede plaats willen we ook de low-risk HPV kunnen detecteren. Hierdoor kan je bijvoorbeeld een condyloom, een seksueel overdraagbaar wratje, diagnosticeren wat belangrijk is voor de juiste behandeling.” De PapilloCheck van Greiner Bio-One was hiervoor de ideale kandidaat, niet in de laatste plaats omdat deze test voor 18 high-risk en 6 low-risk HPV-varianten. De test is uitgebreid gevalideerd en goedgekeurd door de Nederlandse Vereniging voor Pathologie (NVPP), een belangrijke vereiste voor PAMM. Bovendien maakt de test gebruik van relatief korte PCR-fragmenten waardoor de test geschikt is voor de analyse van gefixeerd materiaal. Omdat hierin ook automatisch de typeringen zitten, zie je niet alleen dat het monster bijvoorbeeld HR+ is, maar kun je ook individueel aflezen welke HPV-types er bij de infectie betrokken zijn, zowel wat betreft de high-risk als de low-risk varianten. De check gebeurt hierbij in vijfvoud. Er zijn in totaal 160 spots, met naast vijf spots voor elke variant nog vijf controles: of er DNA in het monster zit, of alle spots effectief aanwezig zijn, of hybridisatie heeft plaatsgevonden, of de PCR goed verlopen is en of de chip juist georiënteerd is. “Deze test geeft zeer eenduidige resultaten, zowel wat betreft het aflezen van de chip als de kwantitatieve data. En als er eens iets verkeerd is gegaan –PCR is op dit moment nog best veel handwerk– geven de controlespots haarfijn aan waar het fout is gegaan.”

 

Interesse in uitgebreide HPV-analyse?

PAMM heeft wat betreft de HPV-analyse een vrij unieke positie in Nederland doordat er getest wordt op zowel low-risk als high-risk HPV met daarbij een directe typering van de betrokken HPV-types. Een test die bovendien geschikt is voor het gebruik van zowel cytologisch als formaline gefixeerd materiaal. Judith kan zich goed voorstellen dat ook in andere ziekenhuizen die informatie van klinisch belang kan zijn voor pathologen of andere clinici. “Als anderen interesse in deze uitgebreide HPV analyse hebben, kunnen ze die monsters naar PAMM sturen voor deze analyse. Er is altijd wel ruimte op de chip om monsters van externen te analyseren.”

 

Greiner Bio-One

www.gbo.com

 

PAMM

www.pamm.nl

 

PAMM, laboratoria voor pathologie en medische microbiologie

PAMM is het regionaal centrum voor infectieziektes en pathologie in Zuidoost Brabant. Het laboratorium voor pathologie zit in Eindhoven op het terrein van het Catharina ziekenhuis en het laboratorium voor medische microbiologie is gevestigd in het Maxima Medisch Centrum in Veldhoven. Sinds 2000 functioneert PAMM als stichting onafhankelijk van deze ziekenhuizen en levert ook diagnostische diensten voor onder andere het Anna ziekenhuis in Geldrop en het Elkerliek in Helmond, waarvan vorig jaar de afdeling Pathologie is gefuseerd met PAMM. Naast de ziekenhuizen wordt ook samengewerkt met 450 huisartsen, GGD, zorginstellingen en verloskundigenpraktijken in de regio, die een kleine 900.000 inwoners telt. In het laboratorium in Eindhoven ligt de nadruk op cytologisch (onderzoek naar cellen) en histologisch (weefselonderzoek) werk. Qua moleculaire biologie is daar het werk beperkt tot de FISH en het isoleren van DNA uit de binnenkomende materialen voor de PCR, die verder worden verwerkt op het gezamenlijke PCR-lab in Veldhoven

KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA