KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA

REDACTIONEEL

EDITIE 32, JUNI 2017

Leids maag-, darm- en leveronderzoek

in stroomversnelling

door nieuwe imaging tool

De afdeling Maag-, Darm- en Leverziekten (MDLZ) van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) doet onderzoek naar de interactie tussen epitheliale cellen, fibroblasten en het immuunsysteem met betrekking tot oncologische en chronische inflammatoire aandoeningen van het maag-darm-leverstelsel. Mark Schoonderwoerd, ruim een half jaar onderweg met zijn promotie-onderzoek, heeft sinds kort de beschikking over een cell imaging multimode reader. Hiermee kunnen geautomatiseerd zijn sophisticated assays worden gevolgd en gekwantificeerd. Dat levert een flinke tijdwinst op voor zijn onderzoek naar de interactie tussen bindweefselcellen en het immuunsysteem in tumoren.

 

 

 

 

 

 

 

Het eiwit endogline, een Transforming Growth Factor (TGF)-β co-receptor, komt in normaal weefsel nauwelijks voor, maar wel veel op nieuwgevormde bloedvaten in tumoren, en is in die hoedanigheid betrokken bij de groei en beweeglijkheid van cellen. Alleen al dit gegeven maakt endogline tot een potentieel target voor therapie met een antilichaam tegen dit eiwit. Immers, door de functie van endogline te blokkeren en zo de vorming van nieuwe bloedvaten tegen te gaan, zou je ook de groei van de tumor en/of het ontstaan van uitzaaiingen kunnen remmen. Het in San Diego gevestigde Tracon Pharmaceuticals is met zo’n antilichaam, TRC105, al een eind op weg: het middel wordt in klinische fase III onderzoek verstrekt aan patiënten met angiosarcoom, een kwaadaardige tumor die ontstaat in de cellen van bloed- of lymfevaten. Luuk Hawinkels, assistant professor en begeleider van Mark Schoonderwoerd, doet inmiddels al meer dan tien jaar onderzoek bij de afdelingen MDLZ en Moleculaire Celbiologie op het gebied van endogline, onder andere in samenwerking met Tracon Pharmaceuticals. Een belangrijke uitkomst van dat onderzoek was de vondst van endogline op bindweefselcellen (fibroblasten) in het gebied van de darmtumor dat ingroeit in het omringende, gezonde weefsel. Bovendien bleek het eiwit bij de ene patiënt sterker tot expressie te komen dan bij de andere. Patiënten met hoge endogline expressie op de fibroblasten hadden vaker metastasen in vergelijking met patiënten die laag endogline op de fibroblasten hadden. Dit leidde tot de vraag of dit eiwit kan dienen als doelwit voor therapieën. Mede door het winnen in 2011 van de Bas Mulder Award, een prijs onder auspiciën van de onlangs weer gefietste en gerende Alpe d'HuZes, konden deze vragen worden onderzocht in het begin dit jaar afgeronde promotie-onderzoek van Madelon Paauwe. Zij toonde als eerste aan dat het neutraliseren van endogline met antilichamen in vivo metastasevorming bij borstkanker sterk remt.

 

Ondernemende OIO

Naast het fundamentele werk voor zijn promotie-onderzoek is Mark Schoonderwoerd ook geïnteresseerd in het toepasbaar maken van wetenschappelijk onderzoek in de kliniek. Daarom is hij samen met drie anderen het bedrijf Levels Diagnostics gestart. Op 8 mei 2017 ontving hij samen met Coen Breedveld, Blandine Le Tallec en Christiaan Roskam uit handen van Philips- CEO Frans van Hout de Philips Innovation Award in de categorie ‘rough diamonds’. Het door hen pas drie maanden eerder opgerichte Levels Diagnostics ontwikkelt een lab-on-a-chip, waarmee huisartsen binnen enkele minuten kunnen differentiëren of er bij de patiënt sprake is van een virale of bacteriële infectie. Door het stellen van de juiste diagnose kan het overmatige en foutief uitgeven van antibiotica worden tegengegaan. Dit is van toenemend belang om antibiotica resistentie te voorkomen. Waar er in Nederland al een zeer terughoudend beleid is in het voorschrijven van antibiotica, is dat in bijvoorbeeld Frankrijk heel anders. Daar worden ze dan ook vaak ten onrechte voorgeschreven. Met de disposable sneltest, waar niet veel meer voor nodig is dan een vingerprikje bloed, kan dit worden vermeden. De gedachte uitvoering is nog geheim; er loopt een patentaanvraag. Mark Schoonderwoerd wil er niet meer over kwijt dan dat Levels Diagnostics geen gebruik maakt van eiwitten. Levels Diagnostics heeft plannen zich te vestigen op het BioScience Park in Leiden. www.levels.bio

 

 

 

 

 

 

 

Stap verder

Doel van het in september vorig jaar gestarte onderzoek van Mark Schoonderwoerd gaat weer een stap verder, legt de promovendus uit: “We willen preciezer weten wat het gevolg is van endogline expressie op de fibroblasten, welke rol het speelt, en hoe we dat het beste kunnen targetten. Daarbij richt ik mij op darm- en alvleesklierkanker. Die laatste is in het perspectief van de fibroblasten extra interessant, omdat deze tumor voor wel 60 tot 95% uit bindweefselcellen kan bestaan, veel meer dan bij andere tumoren. Dat hoge percentage is ook debet aan het niet efficiënt kunnen behandelen van alvleesklierkanker: de tumorcellen zijn minder vatbaar voor chemo- of andere therapie, omdat de fibroblasten ze zo goed afschermen. Mogelijk kunnen we dit bindweefsel zo aanpassen dat het voordelen voor de patiënten geeft. In dat geval kunnen we zowel de nieuwgevormde bloedvaten aanvallen als het overige bindweefsel. Ik kijk daarbij ook nog naar de interactie tussen de bindweefselcellen en het immuunsysteem. Hierbij is het ultieme doel dat de hoeveelheid bindweefsel afneemt waarna we het immuunsysteem weer zo kunnen aanzetten dat de tumoren, die dan niet meer worden afgeschermd door de bindweefselcellen, worden opgeruimd.”

 

 

 

 

 

 

Typische plaatjes die zijn gemaakt met de cell imaging multi-mode reader.
Links een 20x vergroting van een bloedvat in een gezonde pancreas, gekleurd met alfa smooth muscle actine (Alexa 488 groen) en een fase contrast overlay. Rechts een 10x vergroting van een alvleesklier tumor uit een muis met in groen de geactiveerde fibroblasten in overlay met fase contrast. Dit is een mooie illustratie van de grote hoeveelheid fibroblasten in de tumor.

 

Model voor pancreaskanker

Mark Schoonderwoerd is gestart met het opzetten van proefdiermodellen voor het bestuderen van endogline. Als afgestudeerd bioloog met specialisatie ‘animal biology and disease models’ heeft hij al veel ervaring in het werken met proefdieren. Hierin wordt hij bijgestaan door nog zo’n specialist: Eveline de Jonge-Muller, één van de analisten op het door prof. Hein Verspaget geleide onderzoekslaboratorium van MDLZ. Bij het model voor pancreaskanker worden via een kleine operatie met luciferase gelabelde tumorcellen in de pancreas van muizen gespoten. Nadat de tumor, die te volgen is met bioluminescentie, zich heeft ontwikkeld, wordt de te testen medicatie in de buikholte (IP) ingespoten. Als eerste wordt aan de hand van flow cytometrie analyses gekeken hoe het imuuninfiltraat van de tumoren eruit ziet om te kunnen onderzoeken of er een interactie is met het immuunsysteem.

 

Live cell imaging

Om in vitro de effecten van verschillende antilichamen of inhibitoren op het migratiegedrag van fibroblasten te bestuderen, worden verschillende assays uitgevoerd, zoals transmigratie-, scratch- en proliferatie assays. Waar dat voor de onderzoeksgroep tot nu toe zeer tijdrovende experimenten waren, met name door het handmatig kwantificeren, is daar sinds begin mei een enorme efficiëntieslag in gemaakt.

 Met de investering in de door BioSPX geleverde Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader van BioTek kan namelijk dat hele proces nu volledig geautomatiseerd worden doorlopen. Mark Schoonderwoerd illustreert aan de hand van het transmigratie assay de verschillen. “Met de Cytation 5 volstaat het om het 12-wells plaatje met je trans-wells in de houder te plaatsen, het te volgen protocol te selecteren en op ‘play’ te drukken. Het apparaat draait het protocol af en als je ’s-avonds je experiment inzet heb je in de ochtend je gekwantificeerde data. Je kunt het apparaat zo instellen dat hij om de zoveel minuten een foto van de onderkant van je trans-well maakt en dan het aantal cellen telt dat er op zit. Dat scheelt ons heel veel tijd. Bovendien heb je nu ook inzicht in wat er tijdens het migratieproces gebeurt en niet alleen op het eindpunt. Bij de oude werkwijze hadden we alleen een eindpuntanalyse, waarbij je bijvoorbeeld na 24 uur het experiment stopte, de cellen aan de onderkant van de trans-well fixeerde, ze kleurde en ze vervolgens handmatig ging tellen. We hebben nu een student, Roxan Helderman, die wel 30 trans-wells per week doet, maar ook zij is geen partij voor het apparaat! Het enige dat we nu nog handmatig hoeven te doen is het coaten van de trans-well en het uitzaaien van de cellen. Door de bijbehorende CO2-module vinden de assays onder gecontroleerde condities plaats. Bovendien zit er een module bij die zowel fluorescente als normale foto's kan maken; dus feitelijk kan je voor de trans-well alles met dit apparaat.” Ook voor de histologische analyse op de coupes van de tumoren zal het apparaat worden ingezet. “In combinatie met een zojuist aangeschafte module, de DAPI cube, kunnen we ook immunoratio’s bepalen. Hierbij zie je met de fluorescentie kleuring met DAPI al de kernen in het weefsel. Na een vervolgkleuring met DAB (een standaard chromogeen, dat je met de lichtmicroscoop kunt zien), berekent de reader de DAB/DAPI ratio. Dat percentage zegt weer iets over het aantal immuuncellen of het aantal geactiveerde fibroblasten in de coupe. Het scannen van zo’n coupe levert foto's op van wel 3 Gbyte of meer, dus je hebt alle vrijheid om in te zoomen op interessante gebieden in de coupe.”

 

Trans-well

Bij de uitvoering van zo’n trans-well assay komt nog wel wat experimenteel vernuft kijken. Hierbij hang je een soort van gaasje in het welletje van je, in dit geval, 12-wells plaat. In het gaasje zitten minuscule gaatjes van 8 μm doorsnede. Daar leg je een laagje collageen overheen, waar je vervolgens je cellen op uitzaait. Die cellen gaan dan migreren en komen op een gegeven moment aan de onderkant van de trans-well, die een fluorblock heeft, waardoor alleen de cellen aan de onderkant van de trans-well te detecteren zijn. Alleen de cellen die er doorheen komen, worden door de Cytation gedetecteerd. Ook kunnen er op de bodem van de well andere cellen worden uitgezaaid, waarbij in eerste instantie kan worden bepaald hoe hard de migratie naar die cellen verloopt. Het daadwerkelijke experiment is om daar antilichamen tegen endogline of andere inhibitoren aan toe te voegen, en te kijken wat voor effect dat heeft op de migratie. Omdat Mark Schoonderwoerd ook geïnteresseerd is in de immunologische aspecten, maakt hij dit soort experimenten nog een stuk ingewikkelder. “We hebben laten zien dat fibroblasten minder migreren als we endogline targetten, maar ik wil nu weten of die fibroblasten, als we endogline targetten, ook nog iets uitscheiden dat het immuunsysteem activeert of remt. Door verschillende genetische diermodellen kunnen we de interactie van endogline en andere cellen bestuderen. Ik wil weten wat de rol van endogline op het immuunsysteem is. Voor een trans-experiment kun je je dan voorstellen dat we aan de bovenkant immuuncellen uitzaaien. Aan de onderkant zaai je cellen naar keuze uit. En dan kijk je waar die cellen harder naar toe migreren. Omdat we deze processen nu in de tijd kunnen volgen is dat spannender dan ooit!”

 

Kruispunt van onderzoek

Het gros van het laboratoriumonderzoek bij de afdeling Maag-, Darm- en Leverziekten van het LUMC speelt zich af op de speerpunten colorectale kanker, inflammatoire darmziekten en leverziekten. Naast het promotie-onderzoek van Mark Schoonderwoerd naar darmkanker, lopen er projecten in het kader van poliepen, de behandeling van chronische darmontsteking, de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa met mesenchymale stamcellen, evenals bij chronische leverziekte. Naast laboratoriumonderzoek vindt er ook veel klinisch onderzoek plaats bij MDLZ. Hiervoor staat ook een biobank ter beschikking met patiëntenmateriaal dat goed is voor een follow-up van meer dan tien jaar aan klinische data. Hoofd van het laboratorium is Hein Verspaget, die tevens hoogleraar Biobanking is. De expertise van de andere hoogleraren is op het gebied van colorectale tumoren (James Hardwick), erfelijke darmtumoren (Hans Vasen) en hepatologie/levertransplantatie (Bart van Hoek).

 

BioSPX

www.biospx.nl

 

Afdeling Maag-, Darm- en Leverziekten

www.lumc.nl/org/mdl

Mark Schoonderwoerd bij de door BioSPX geleverde Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader van BioTek.

Het laboratorium van afdeling Maag-, Darm- en Leverziekten, met op de voorgrond analist Johan van der Reijden.

AGENDA

KOOPJESHOEK