EDITIE 32, JUNI 2017

Aangepaste pipetteerprotocollen zijn indicator

voor dynamiek in pre-klinisch onderzoek Synthon

Ruim 25 jaar na de start als ontwikkelaar en producent van generieke geneesmiddelen op basis van ‘small molecules’ heeft het Nijmeegse Synthon inmiddels zijn eerste, zelf ontwikkelde biofarmaceutische geneesmiddel in klinische ontwikkeling. Met de verbreding van de focus naar innovatieve ontwikkeling is ook het pre-klinisch lab opgericht, waar nu meer dan 30 mensen werken. Eén daarvan is Karin de Laat, die zich inspant om het vele pipetteerwerk dat is gemoeid met de eiwit-receptor-interactie-assays te automatiseren.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SYD985 zou wel eens het eerste door Synthon zelf ontwikkelde, biofarmaceutische geneesmiddel kunnen worden dat zal worden toegelaten op de markt. Wanneer dat gaat gebeuren is nog niet te voorspellen. Momenteel bevindt dit kandidaatgeneesmiddel tegen onder andere borstkanker zich in fase I van het klinisch onderzoek. SYD985 bevat een antilichaam dat gericht is tegen tumoren die een hoge HER2-expressie hebben, zoals sommige borstkankertumoren. Het HER2-eiwit speelt een belangrijke rol bij de groei van kankercellen door het ontvangen en doorgeven van groeisignalen aan de cel. Indien heel veel HER2 aanwezig is op het celoppervlak, wordt het normale regelmechanisme in de cel in de war gestuurd door overmatig veel groeisignalen. Er is dan sprake van ‘HER2- neu overexpressie’, ofwel ‘HER2-positiviteit’. Dit komt voor bij circa 15% van alle borstkankers, en heeft een ongunstige invloed op de prognose.

 

Meerwaarde door linker-drugtechnologie

 

 

 

 

 

 

 

SYD985 bestaat feitelijk uit het antilichaam trastuzumab met daaraan gekoppeld (‘geconjugeerd’) een voor de doeltumor toxische verbinding. Hiervoor is de ADC (‘antibody-drug-conjugate’) technologie van het in 2011 ingelijfde bedrijf Syntarga –een spin-off van de Radboud Universiteit– gebruikt. Bij deze benadering fungeert het antilichaam niet zozeer als werkzame stof, maar meer als precisie-transporteur van het toxine. Door de selectieve binding van het antilichaam aan HER2 kan dat toxine heel effectief naar binnen worden getransporteerd en zorgen voor selectieve celdood. In het geval van SYD985 is die werking anders dan die van concurrerende producten zoals Kadcyla en trastuzumab. Die geneesmiddelen zijn vooral effectief tegen borstkankertumoren met extreem hoge HER2-expressie (HER2 3+). SYD985 is echter ook effectief bij tumoren met een lagere HER2-expressie, waardoor de patiëntengroep die uiteindelijk baat bij de therapie heeft veel groter zou kunnen zijn dan bij Kadcyla. Daarnaast zou SYD985 vanwege dit bredere spectrum ook voor andere HER2-gerelateerde typen kanker kunnen worden ingezet, iets wat momenteel in aanvullende fase I studies wordt onderzocht. Synthon is uiteraard niet de enige in de markt die gebruik maakt van linker-drugtechnologie, maar heeft het voordeel ten opzichte van andere ADC’s dat de toxine er niet voortijdig van af kan vallen. Als dat namelijk gebeurt voordat het ADC zijn doelcel heeft bereikt, kunnen allerlei bijwerkingen optreden. De linker-drug van Synthon ondervangt dit risico doordat het conjugaat pas op het moment van internalisatie wordt geknipt door een protease, waardoor het dan pas in een actieve vorm wordt omgezet.

“Bijna iedereen die binnen de innovatieve businessunit werkt,
heeft wel aan SYD985 gewerkt.  Voor veel van die mensen geldt ook dat ze nog nooit een product naar de markt hebben zien gaan waar ze aan meegewerkt hebben.”

Pre-klinisch onderzoek

Researcher Karin de Laat, die sinds 2009 bij Synthon werkt, heeft de ontwikkeling van de innovatieve tak bijna vanaf het begin meegemaakt. “Toen ik bij Synthon kwam werkten er rond de 50 mensen in deze businessunit; inmiddels zijn dat er meer dan 250. Aanvankelijk was de focus gericht op het maken van biosimilars, met voor mij analysetaken bij BA (Bio-Analytics) om de productkwaliteit bij zowel upstream- als downstreamprocessing te controleren. Nadat was besloten om te focussen op de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen, is de afdeling Pre-Clinical opgezet. Daarbij wordt voor de analyse niet zozeer uitgegaan van bekende stoffen, zoals bij de productie van biosimilars, maar van een bepaald target, waarvoor een hele rits compounds wordt gemaakt, die in in vitro cell based assays en in bioanalytische bepalingen getest moeten worden op hun werkzaamheid.” Binnen het pre-klinisch lab werken onder andere de groepen: in vitro farmacologie, ‘protein interaction’ en toxicologie. Die onderverdeling hangt vooral samen met de gebruikte technieken en de daarvoor benodigde expertise. Bij ‘protein interaction’, de groep waar Karin werkt, zijn dat bijvoorbeeld SPR en BLI technologie om de affiniteit van het ADC voor een receptor te meten, generieke ELISA assays om de ADC’s terug te meten uit plasma (kinetiekstudies), en screening van compounds aan de hand van binding aan recombinante receptoren met behulp van de SPR-technologie. In de in-vitro-farmacologiegroep kijken de onderzoekers veel meer naar het effect op cellen, en is bijvoorbeeld de EC50 een belangrijke parameter. Binnen de toxicologie kijkt men vooral naar de bijwerkingen en juist niet de therapeutische werking. De resultaten van al die methoden bepalen uiteindelijk of een compound verder het ontwikkeltraject in gaat. Met soms een keihard ‘nee’ vanuit bijvoorbeeld toxicologie. “Hoe effectief het middel in vitro ook is, als de toxicologiestudie te slechte resultaten geeft, dan is het over en uit”, aldus Karin de Laat.

 

Generieke assays

 Om de gesynthetiseerde ADC’s terug te meten uit plasma zijn op de afdeling ‘protein interaction’ generieke assays ontwikkeld. Omdat hiermee heel veel pipetteerwerk is gemoeid, is besloten om dit werk zo veel mogelijk te automatiseren, in dit geval met de PipetmaX van Gilson, een automatisch pipetteersysteem met twee 8-kanaals pipetkoppen. Extra uitdaging hierbij was dat het vooral om plasmamonsters van muizen ging, die tijdens de kinetiekstudies meerdere malen moesten worden bemonsterd. Consequentie daarvan is dat er niet zoveel bloed afgenomen kan worden, in dit geval slechts 100 tot 150 μl per keer. “Bij die kleine hoeveelheden is je systeem relatief gevoelig voor onregelmatigheden in deze hoog-visceuze monsters, zoals een stolseltje of een eiwitpropje. Bij handmatig werken kan je daaromheen pipetteren, maar een robot ziet dat soort onregelmatigheden niet, waardoor je in dergelijke gevallen toch handmatig moet pipetteren. Maar doordat we de PipetmaX de ijklijnen kunnen laten pipetteren scheelt het ons meer dan de helft van de tijd, dus de winst is aanzienlijk”, vertelt Karin de Laat. De viscositeit van het plasma bracht ook extra uitdagingen met zich mee voor het programmeren van de robot, omdat de instellingen afwijken van die van waterige bufferoplossingen. Alle parameters moesten daarvoor worden aangepast. “Omdat de dynamiek binnen ons onderzoek ook bij ons voor heel afwisselend werk zorgt –we switchen regelmatig tussen technieken voor het bestuderen van de eiwit-eiwit-interacties– kun je op dat gebied nauwelijks de benodigde routine opbouwen. Dit werk is nu gedaan door Casper Koolen (service & support engineer bij Gilson en Europees product specialist voor PipetmaX, red.), die uitstekend onze wensen heeft vertaald in een robuust pipetteerprotocol. Daar zijn we inclusief het testen wel enkele maanden mee bezig geweest, maar die investering heeft niet alleen ons veel profijt opgeleverd in de vorm van tijdwinst bij het pipetteren, maar ook Gilson zelf, waar ze nu meer kennis hebben over hoe met visceuze oplossingen als plasma om te gaan.”

 

Herschrijven

De onderzoeksdynamiek binnen Synthon kan echter niet altijd rekening houden met de tijd die nodig is om te komen tot zorgvuldig uitgewerkte pipetteerprotocollen. In de periode waarin intensief pre-klinische studies werden uitgevoerd voor SYD985 met verschillende tumoren, moesten heel veel platen van dezelfde compound worden getest. “Je had dus maar één ijklijn nodig, die je voor heel veel verschillende monsters kon gebruiken. Die monsters werden allemaal in epjes aangeleverd, die allemaal geopend moesten worden om de gewenste hoeveelheid eruit te pipetteren. Die standaard handelingen konden uitstekend door de robot worden gedaan, en volgens het uitgedokterde protocol verder worden verwerkt voor de testen.” Inmiddels is SYD985 opgeschoven in de pijplijn en staan er nieuwe compounds te dringen om te worden getest. “Dan heb je als analist bijvoorbeeld de situatie dat je zes verschillende compounds moet testen, maar nu maar vijf monsters per compound hebt. Met een protocol dat is geschreven om voor één compound meerdere platen te kunnen vullen, kan je dan niet meer uit de voeten. Je hebt nu te maken met meerdere compounds waarvan een ijklijn moet worden gemaakt, die daarna verdeeld moeten worden over meerdere platen. Het protocol is derhalve herschreven door Casper en wordt nu geïmplementeerd in het protein-interaction-lab. Voordeel is wel dat factoren als buffers en het visceuze plasma niet veranderen, zodat je dat niet meer helemaal opnieuw hoeft uit te zoeken.”

 

 

 

 

 

 

 

384 sneller vol

Waar de PipetmaX uitkomst bood voor het 96-wells-werk, zet Karin de Laat de PlateMaster in om het handmatig pipetteren van 384-wellsplaten zoveel mogelijk te beperken. Dat formaat platen wordt onder meer gebruikt bij een assay voor het bepalen van de immunogeniciteit, de reactie van een patiënt om bij behandeling antilichamen te gaan produceren tegen het geneesmiddel, de zogenaamde ADA-formatie (anti-drugantibody). Het is belangrijk om patiënten daarop te screenen, omdat in dat geval een geneesmiddel snel onwerkzaam kan worden gemaakt en behandeling ermee geen zin meer heeft. De gezondheidsautoriteiten schrijven voor dat in een klinische studie op immunogeniciteit moet worden getest, en daar moet je dus ook een assay voor ontwikkelen. Bij Synthon maken ze hiervoor gebruik van een technologie die werkt met zeer gevoelige fluorescentiedetectie, zodat je voor de noodzakelijke hoeveelheden monster met het 384-format aan de slag kunt. “Het handmatig pipetteren van 384 welletjes is een hele klus. In het geval van de test op immunogeniciteit moesten we vanuit een 96-wells-plaat vier keer overpipetteren om die 384-plaat vol te krijgen, en dat ook nog eens voor verschillende settings (duplo’s, met en zonder compound). Dat werk alleen al kostte ruim een half uur, waardoor je ook een half uur tijdverschil krijgt tussen de eerst gevulde welletjes en de laatste. Dat tijdverschil zie je terug in de variatie in de testresultaten. Nu gebeurt dat pipetteerwerk in vier grote stappen, waardoor je binnen vijf minuten klaar bent en minder variatie hebt.”

 

Minder kopzorgen

Het automatiseren van standaard pipetteerwerk levert letterlijk minder kopzorgen. “Tijdens preklinische studies kon het zo maar voorkomen dat mensen twee, drie uur per dag aan het pipetteren waren. Dat is niet zozeer lichamelijk zwaar, maar vooral geestelijk: het kost heel veel energie om zo lang supergeconcentreerd te blijven werken. Vooral werken met 384-wells-platen is wat dat betreft een uitdaging, want bij die kleine volumina kun je amper zien waar je bent gebleven”, stelt Karin de Laat. Ondanks de automatisering is het niet minder druk geworden in de pre-klinische laboratoria. Dat heeft alles te maken met het groeiende aantal ADC’s en andere compounds dat Synthon in ontwikkeling heeft. En natuurlijk ook het benodigde laboratoriumwerk om SYD985 succesvol door de verschillende klinische fasen te loodsen. Wat dat betreft zijn de verwachtingen bij Karin de Laat (en ook bij haar collega’s) hooggespannen: “Bijna iedereen die binnen de innovatieve businessunit werkt, heeft wel aan SYD985 gewerkt. Voor veel van die mensen geldt ook dat ze nog nooit een product naar de markt hebben zien gaan waar ze aan meegewerkt hebben. We zijn dan ook supertrots dat we al zo ver zijn gekomen!”

 

Gilson International

www.gilson.com

 

Synthon

www.synthon.com

Researcher Karin de Laat maakt bij Synthon gebruik van de Gilson PipetmaX voor het automatisch pipetteren van minimale hoeveelheden plasma.

Met de PlateMaster kan het handmatig pipetteren van 384-wells platen zoveel mogelijk worden beperkt.

Jochem Eigenhuijsen en student Sjoerd Bosch in het ‘protein interaction’ gedeelte van het pre-klinisch laboratorium van Synthon, waar ruim 30 mensen werkzaam zijn.

KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA