EDITIE 31, MAART 2017

Nieuw leverweefsel maken, als mandarijnen in een netje

Met zo’n 60 levertransplantaties per jaar is het Erasmus MC in Nederland koploper qua levertransplantaties. Dat zie je ook terug in het transplantatie- onderzoek dat is geconcentreerd in het LETIS, het Laboratorium voor Experimentele Transplantatie en Intestinale Chirurgie.
Jorke Willemse is er een half jaar geleden zijn promotie-onderzoek gestart naar manieren om nieuw leverweefsel te maken, onder andere door eerst het leverraamwerk helemaal fijn te malen...

 

 

 

 

 

 

 

 

Jaarlijks worden in Nederland tussen de 140 en 170 levertransplantaties uitgevoerd. De vraag is echter groter dan het aanbod en daarom is er een wachtlijst die zo lang is dat jaarlijks tientallen patiënten al zijn overleden voordat ze aan de beurt zijn. “Voor die mismatch zijn verschillende oorzaken”, stelt Monique Verstegen, senior onderzoeker bij het LETIS, het Laboratorium voor Experimentele Transplantatie en Intestinale Chirurgie van het Erasmus MC. “Uiteraard is dat een gebrek aan donoren, maar we zien ook dat de kwaliteit van de aangeboden levers minder wordt: ze worden ten gevolge van onze hoge levensstandaarden onder andere steeds vetter. En vet is niet goed voor een lever. Zo kan vetgerelateerde fibrose –naast alcoholgerelateerde cirrose– zich ontwikkelen tot een stadium waarbij transplantatie nog de enige effectieve behandeling kan zijn.” Om het succes van levertransplantaties te verhogen –dat ook kwalitatief mindere levers kunnen worden gebruikt en/of de kans op infecties na transplantatie kleiner is– vind bij LETIS onderzoek plaats naar weefselschade en infectie van orgaantransplantaten, en hoe die te herstellen zijn. Een clubje van twaalf onderzoekers en technicians, onder leiding van Luc van der Laan, voeren hun levergerelateerde onderzoek uit in de laboratoria van Maag-, Darm- en Leverziekten (MDL), waar alle benodigde apparatuur, kennis en vaardigheden aanwezig zijn, onder andere voor het kweken van leverstamcellen.

“Je kunt het leversysteem vergelijken met mandarijnen in een netje, waarbij de mandarijnen staan voor de levercellen en het netje voor het geraamte, de scaffold.”

Mandarijnen in een netje

Levers bouwen of stukjes lever maken biedt door de pijlsnelle ontwikkelingen op het gebied van stamcellen en kweektechnieken steeds meer perspectief voor het verbeteren van levers voor transplantatiedoeleinden. Jorke Willemse, afgestudeerd bij Biomedical Engineering in Twente, met als specialisatie Tissue Engineering, is eind 2016 gestart met zijn PhD-onderzoek dat wordt begeleid door transplantatie chirurg Jeroen de Jonge en Monique Verstegen. Het is zijn taak om uit te zoeken hoe transplanteerbare constructen gemaakt kunnen worden. “Met een beetje fantasie kan je het leversysteem vergelijken met mandarijnen in een netje, waarbij de mandarijnen staan voor de levercellen en het netje voor het geraamte, de scaffold. Als er in dat netje een paar rotte mandarijnen zitten, functioneert die niet goed. Een optie is dan om de mandarijnen eruit te halen en er vervolgens nieuwe mandarijnen, gezonde cellen in te brengen. Dat is makkelijker gezegd dan gedaan, want als als je hepatocyten –dat zijn de levercellen– uit de gezonde lever haalt, kunnen we ze in vitro niet op plastic kweken; na een paar dagen sterven ze af. Ze hebben, blijkt uit onderzoek, cel-cel interacties nodig en moeten ook aan dat netje, de extracellulaire matrix (ECM), vastzitten. En dan zijn er ook nog bepaalde specifieke factoren nodig in het medium. Een heel complex systeem dus, dat we tot nu toe in vitro niet goed kunnen nabootsen”, legt Jorke Willemse uit.

 

Uitgaan van de matrix

Leverconstructen zou je ook kunnen maken door uit te gaan van de matrix. De eerste stap in dat proces is het verwijderen van alle cellen uit humane levers, zodat je de matrix overhoudt. In het geval van het Rotterdamse onderzoek zijn dat levers die zijn gedoneerd, maar niet voor transplantatie in aanmerking komen. Met goedkeuring van de familie mogen die levers voor het onderzoek worden gebruikt. Na aansluiting van de arteriën en venen van de lever op een pompsysteem wordt met een vrij zwaar detergens als Triton X-100 de lever gedurende vier tot zes weken gespoeld. Hierbij worden de celmembranen gelyseerd, zodat de celinhoud vrijkomt in de matrix.

 

Door lang te spoelen verdwijnt dat geleidelijk. De structuur van de lever blijft hierbij min of meer intact. Met de van cellen ontdane matrix kan je verschillende experimenten doen. “Grofweg zijn er drie benaderingen om de cellen er weer terug in te stoppen”, zegt Jorke Willemse. “De eerste is het lamineren van de lever, er hele dunne plakjes van 50 tot 200 μm afsnijden en daar vervolgens cellen opleggen. Omdat de structuur zo plat is, noemen wij dat 2D-experimenten. Je kunt dan kijken of die cellen zich hechten aan de matrix, functionele analyses uitvoeren, wat er gebeurt als we hepatocyten of leverstamcellen toevoegen. Nadeel van deze opzet is dat je heel lastig iets over het systeem kunt zeggen. Wat dat betreft heeft de tweede benadering de voorkeur, waarbij we de levermatrix als bulk nemen. In feite sluit je dan de lege matrix weer aan op de pomp en pomp je er cellen doorheen, in de hoop dat ze hechten en op de juiste plek terecht komen. Daar zitten echter praktisch nogal wat haken en ogen aan. Alleen al het feit dat je hiervoor miljarden cellen nodig hebt, die stabiel en gezond zijn, maakt het bijzonder lastig om dit soort experimenten succesvol uit te voeren.”

 

Best of both worlds

Een derde benadering, waar Jorke momenteel aan werkt, is het maken van een gel van de levermatrix. Hierbij vernietig je de 3D-structuur en mix je alle matrixcomponenten in een suspensie waar je vervolgens een gel van maakt. “Op het eerst gezicht lijkt dat een vrij onzinnige actie, omdat juist die structuur zo belangrijk is voor het goed functioneren en groeien van de cellen, hebben we geleerd. Om het nut te begrijpen moeten we iets verder de lever induiken. Belangrijk is te weten dat er naast de alomtegenwoordige hepatocyten, die het merendeel van de leverfuncties uitvoeren, nog heel wat andere soorten cellen in de lever zitten. Denk daarbij aan de cholangiocyten aan de binnenkant van de galwegen en endotheelcellen die de binnenkant van de bloedvaten bekleden. En niet te vergeten een hele rits aan immuuncellen, kupffercellen en macrofagen die belangrijk zijn voor het opruimen van dode cellen. Die cellen vormen samen het functionele weefsel en het idee is dat elk functioneel weefsel in de lever zijn eigen matrix heeft: de levermatrix ziet er anders uit dan de matrix die rond de bloedvaten ligt, en heeft ook een andere samenstelling. Omdat je in je gel random al die matrixcomponenten kunt aanbieden, zal een specifieke cel altijd wel iets van zijn gading kunnen vinden. Heel anders dan bij de intacte 3D-structuur, waar je als levercel niets te zoeken hebt op een bloedvatwand. En in zekere zin is zo’n gel nog steeds weefselspecifiek: als je hepatocyten wilt kweken, en 70 % van de matrix een hepatocytomgeving is en 30 % iets anders, dan is dat relatief weefselspecifiek. De gel is in die zin een robuust model om 3D cellen te kweken.”

 

Malen

Voor het maken van zo’n gel is een apparaat aangeschaft dat je niet vaak ziet in een moleculair lab: de ultracentrifugaalmolen ZM 200 van Retsch. Met deze door Verder- Scientific geleverde rotormolen worden gevriesdroogde stukjes lever gemalen tot deeltjes die kleiner zijn dan 200 μm. Door de centrifugaalkracht worden de deeltjes met grote energie naar buiten geslingerd, waar ze door de impact voorvermalen worden tegen de wigvormige tanden van de rotor. Vervolgens wordt het monster fijn vermalen tussen de rotor en de ringzeef. Deze tweestaps vermaling garandeert een geleidelijke maar snelle verwerking, waardoor de eigenschappen van het monster niet veranderen. De gevormde deeltjes worden vervolgens bij lage pH gedigesteerd met pepsine, dat de collageen fibers in kleine stukjes opknipt. Als dat is gebeurd, is de matrix volledig opgelost en is er sprake van een vrij visceuze vloeistof. Met deze vloeistof wordt vervolgens een truc uitgevoerd, waardoor de gel kan worden gevormd en de matrixcomponenten in een netwerk kunnen worden gevangen. “We brengen de vloeistof eerst naar een neutrale pH, zodat de pepsine afbreekt. Als we die oplossing ook nog eens op 37 °C brengen is het voor die collageenstukjes energetisch voordeliger om fibers te vormen. Dus die vormen zelf weer lange fibers, zodat er een matrixachtig netwerk ontstaat, die de basis is van de gel. Het exacte mechanisme hierachter weten we nog niet; het is een beetje een black box, maar we kunnen een gel maken waar we vervolgexperimenten mee kunnen doen”, zegt Jorke Willemse.

 

Vullen en differentiëren

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Monique Verstegen is sinds vier jaar senior
onderzoeker bij het LETIS, het Laboratorium
voor Experimentele Transplantatie en
Intestinale Chirurgie van het Erasmus MC.
Daarvoor werkte ze bij Hematologie waar zij
zich ook al toelegde op stamcellen.

“De gel kan worden gevuld met leverstamcellen die we expanderen in een kweekbakje en vervolgens in de lege matrix brengen”, vertelt Monique Verstegen over het vervolgonderzoek. “We kunnen er vrij gemakkelijk cellen aan toevoegen door in het pre-gel stadium de gekoelde oplossing, waar de collageen fibers zich nog niet opnieuw hebben gevormd, te mengen met een celsuspensie met de te onderzoeken cellen. Nadat je die samenstelling onder fysiologische condities hebt gebracht, zitten de cellen in de matrix, in een weefselspecifieke omgeving. We denken dat onze leverspecifieke gel van grote waarde kan zijn om de differentiatie van stamcellen naar hepatocyten te bewerkstelligen. Daar werken we op dit moment aan. Door variatie in het medium, de samenstelling van de gel, allerlei componenten die we erbij stoppen, proberen we de optimale omstandigheden te creëren voor die differentiatie.”

 

Succes

Vanuit een rotsvast vertrouwen dat het gaat lukken om die gel te maken geeft Monique Verstegen alvast inzicht in de volgende onderzoeksstappen. “We kunnen ‘disease modelling’ gaan bedrijven door cellen van patiënten met leverziekte te nemen en dan heel gericht te kijken naar wat voor ziekte ze hebben, en met wat voor medicijnen we die ziekte kunnen verhelpen. Heeft de patiënt een bepaalde genetische afwijking en kunnen we dit met een bepaald medicijn tegengaan, dan kunnen we dat nu eerst in vitro testen op de eigen cellen van de patiënt voordat we het middel daadwerkelijk aan de patiënt geven. Dat model werkt ook de andere kant op. In gekweekte constructen met gezonde cellen breng je een bepaalde mutatie aan en kijk je wat er gebeurt, bijvoorbeeld met betrekking tot de ontwikkeling van tumoren. De gel zouden we ook kunnen gebruiken om heel veel cellen te expanderen en te differentiëren en die vervolgens in een andere ‘decelled scaffold’ te stoppen, want dat blijft toch je ultieme doel: leverconstructen te maken, misschien geen hele, maar dat toch groot genoeg om het herstel van een aangedane lever te bevorderen; daar heb je soms maar 10 % gezond weefsel voor nodig!”

 

Verder-Scientific

www.verder-scientific.nl

www.retsch.nl

 

Laboratorium voor Maag-, Darm en Leverziekten

www.erasmusmc.nl/gastrolab

Onderzoeker in opleiding Jorke Willemse maakt gebruik van de door Verder-Scientific geleverde ultracentrifugaalmolen ZM 200 van Retsch om gevriesdroogde stukjes lever te malen tot deeltjes die kleiner zijn dan 200 μm.

De structuur van een humane lever waaruit alle cellen zijn verwijderd blijft door de matrix min of meer intact.

KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA