EDITIE 30, SEPTEMBER 2016

Weken synthetiseren voor een paar gram superzuivere moleculen

Het op het terrein van het UMC Groningen gevestigde bedrijf Axon Medchem heeft in zijn tienjarige bestaan al bijna tweeduizend verschillende organische verbindingen gesynthetiseerd voor farmaceutische bedrijven en onderzoeksinstellingen. De organisch chemici gaan hierbij voor zuiverheden van meer dan 98 %, iets dat ze bereiken door een combinatie van geoptimaliseerde syntheseroutes en nauwgezet opzuiveren na elke synthestap.

 

 

 

De ruit van de zuurkast wordt doorgaans
gebruikt voor kattebelletjes en
aandachtspunten. Voor LabVision tekende
Jelle Nijhuis deze reactiestap die werd
uitgevoerd tijdens de synthese van TEPP-46,
een pyruvaat kinase M2 activator.

Als je een beeld wilt krijgen van de enorme diversiteit aan fundamenteel en (pre)klinisch onderzoek naar om het even welk therapeutisch gebied, moet je eens door de catalogus struinen op de website van het Groningse bedrijf Axon Medchem. Daar vind je een kleine tweeduizend hoofdzakelijk klein-moleculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt voor farmaceutisch en biomedisch onderzoek. Voor honderden verschillende targets, van 5-HT1A receptoren tot het gammasecretase enzym, voor onderzoeksgebieden als centraal zenuwstelsel, celsignalering & oncologie, immunologie en stamcellen, voor pathways als JAK-STAT en p53 tumorsuppressie, voor verschillende soorten ionkanalen, receptoren en eiwitten. Je kunt het zo gek niet bedenken of het wordt wel door de zeven organisch chemici gemaakt die zich bij Axon Medchem fulltime bezighouden met de synthese van deze bioactieve moleculen, die onder de naam Axon Ligands worden vermarkt.

 

 

 

 

In het laboratorium van Axon Medchem heeft ieder van de zeven organisch chemici zijn of haar eigen zuurkast waar in de regel aan twee of drie syntheseprojecten tegelijk wordt gewerkt.

 

“Door nauwgezet de relevante vakliteratuur bij te houden, ogen en oren open te houden bij symposia en congressen, goed te luisteren naar klanten en natuurlijk ook de concurrentie in de gaten te houden hebben we zicht op de nieuwste targets tegen enzymen, eiwitten, receptoren, de trends waarin onderzoek zich lijkt te begeven. Met de nadruk op lijkt, want onderzoek leidt weer tot nieuwe inzichten, die vaak weer andere bioactieve moleculen vergen. Neem een begrip als selectiviteit, dat vaak heel betrekkelijke blijkt te zijn. Aanvankelijk wordt er getest voor een bepaald biologisch target en dan wordt geconcludeerd dat het heel selectief is voor een bepaald enzym of receptor. Maar naarmate dat product langer op de markt is, en in meerdere onderzoeken is getest, blijkt het met die selectiviteit wel mee te vallen, grijpt het ook aan op andere enzymen, receptoren”, vertelt Erik Vermeulen, project manager bij Axon Medchem. Axon Medchem, dat in 2006 is gevormd als spinoff van Axon Biochemicals, is van oudsher actief in moleculen voor onderzoek aan het centraal zenuwstelsel, waar het zo’n 200 producten voor aanbiedt. Gaandeweg is de portfolio uitgebreid naar met name oncologisch onderzoek, dat heel breed is en waarin ook nog eens veel geld in omgaat, zodat er dus veel vraag naar een grote diversiteit aan verbindingen is. Relatief nieuwe gebieden waar Erik Vermeulen veel potentie voor zijn bedrijf in ziet zijn stamceltherapie en epigenetisch onderzoek.

“Het ontrafelen van de mechanismen, het bepalen van kritische factoren voor een eventuele therapeutische werking vergt enorm veel onderzoek met veel verschillende moleculen. Daarin zien we momenteel een enorme boost, waarin wij de onderzoekers kunnen helpen door de benodigde organische verbindingen in een hoge zuiverheid vanuit voorraad te leveren.”

 

 

 

 

 

Organisch chemicus Remco Hofman werkt
sinds anderhalf jaar bij Axon Medchem en is
samen met zijn collega Jelle Nijhuis
verantwoordelijk voor het beheer van de
analyse apparatuur.

 

Synthetiseren

De synthese van die verbindingen, doorgaans in hoeveelheden van 5 tot maximaal 20 gram, vindt plaats in het laboratorium van Axon Medchem door een zevental organisch chemici. Jelle Nijhuis, sinds twee jaar werkzaam bij het bedrijf, ➞ legt uit hoe dat in zijn werk gaat. “Net als mijn collega’s heb ik mijn eigen zuurkast waarin ik de geplande syntheses uitvoer. Meestal ben je vanwege de lange reactietijden met drie projecten tegelijk bezig. Het voorschrift voor de synthese van een verbinding halen we uit de literatuur. Ga je een verbinding voor de eerste keer maken, dan komt daar vaak wat uitzoekwerk bij. Wat in de literatuur beschreven staat, werkt niet altijd even goed in de praktijk. Soms moeten we wel eens een omweg nemen om tot het beoogde resultaat te komen. Is de verbinding al eerder gesynthetiseerd, dan kun je uitgaan van het werkvoorschrift, al komt het dan ook nog regelmatig voor dat je optimaliseringsslagen maakt om de opbrengst nog verder te verhogen. Je moet bedenken dat er stoffen bij zitten die we in meer dan tien stappen synthetiseren. Je kunt dan met honderden grammen aan uitgangsstoffen beginnen, maar dan moet je –zeker met een of meer moeilijk lopende tussenstappen– behoorlijk aan de bak om nog een paar gram zuivere stof over te houden.” Ofschoon de zeven organisch chemici allemaal hetzelfde soort werk doen, is de variatie juist erg groot. “Voor elke verbinding is de synthese verschillend. Je ziet wel regelmatig dezelfde reactietypen als een Diels-Alder reactie of een Friedel-Crafts alkylering, maar er zitten maar weinig verbindingen tussen waarbij de syntheseroutes op elkaar lijken. Als je een iets ander substraat hebt, kan dat al een groot verschil maken in de reactie, een andere uitkomst geven. Vaak zijn er meerdere mogelijkheden, waardoor je altijd scherp moet blijven om tot een optimaal resultaat te komen, en dat maakt het werk zo leuk”, aldus Jelle Nijhuis.

 

Zuiver

Axon Medchem onderscheidt zich door de zuiverheid van de verbindingen. “We streven een zuiverheid na van minimaal 98 %. Maar als een klant 99 % wil, kunnen wij daar ook voor zorgen, als het tenminste mogelijk is, want soms is het makkelijker gezegd dan gedaan”, zegt Remco Hofman, die net als Jelle Nijhuis organische syntheses uitvoert. Daarnaast is hij hoofdverantwoordelijk voor het onderhoud van de (analytische) labapparatuur. “Aan de hand van LC-MS, NMR en elementanalyse bepalen we de zuiverheid van de gesynthetiseerde verbindingen. Met NMR bekijken we ook of er nog oplosmiddelen inzitten, want het is belangrijk dat die er uit zijn. Als dat goed is, voeren we met elementanalyse een final check uit. We meten hierbij C, H en N. Als de verhouding van die elementen met betrekking tot de gesynthetiseerde verbinding klopt, dan weten we met grote zekerheid dat we het juiste molecuul hebben gemaakt. In het algemeen bereiken we zelden direct de gewenste 98 % zuiverheid. Daar moeten vaak nog extra zuiveringsstappen als herkristalliseren of wassen aan te passen komen, en dan check je nog een keer. Is het nog niet goed, dan herhaal je die stappen, een beetje rinse & repeat!”

 

Scheiden na elke stap

Om aan de gewenste eindzuiverheid te komen is het noodzakelijk om na iedere reactiestap het mengsel te zuiveren. “Je begint met je substraat, je startmateriaal, daar maak je vaak een intermediate van en dat wordt door een andere reactie weer een volgend intermediate en uiteindelijk heb je je eindproduct. Je kunt die stappen niets patsboem doorzetten, omdat allerlei bijproducten voor problemen kunnen zorgen in een volgende reactiestap; je weet nooit exact wat er gaat gebeuren. Zeker bij de laatste stap is het belangrijk om met een zo zuiver mogelijk intermediair te werken; dat komt de opbrengst het meest ten goede”, legt Jelle Nijhuis uit. Voor die zuiveringsstappen maken de organisch chemici gebruik van het door Büchi Labortechnik geleverde Reveleris X2 flash chromatografiesysteem. Hierbij wordt het reactiemengsel over een prepacked kolommetje geleid, waarbij na fractioneren met een zuiverder mengsel verder kan worden gewerkt. “We hebben dit instrument nu een jaar in gebruik. Aanvankelijk moesten de gebruikers er even aan wennen, omdat er heel veel opties inzitten. Maar nu werkt iedereen er zelfstandig mee, zonder problemen. Ook qua onderhoud hebben we er nauwelijks omkijken naar. De kolommen gebruik je één keer, dus daar kan weinig aan misgaan. Het schoonmaken is relatief eenvoudig: purgen, spoelen en klaar. Alleen de ELSD moet je regelmatig schoonmaken, maar dat valt allemaal reuze mee”, vertelt Remco Hofman.

 

Tijd besparen

Voordeel van het Büchi Reveleris X2 systeem is dat een run nooit langer dan 45 minuten duurt, en dat er veel minder eluens hoeft te worden gebruikt. “Met handmatige kolommen kon je –afhankelijk van de hoeveelheden en de mate van scheiding– wel een hele dag bezig zijn. Wat hierbij meehelpt is dat je de beschikking hebt over vier detectiekanalen: drie UV-kanalen die instelbaar zijn tussen 200 en 350 nm, en de ELSD, de ‘evaporative light scattering detector’, die door het meetprincipe ook informatie geeft over niet-UV-actieve componenten”, stelt Jelle Nijhuis. “Daarbij kunnen we hiermee ook heel goed reversed phase scheiden. Dat is een uitkomst bij verbindingen die we met normal phase niet goed kunnen scheiden omdat de retentiewaarden heel dicht bij elkaar liggen. Met reversed phase kunnen we ook de condities van de LC-MS nabootsen, zodat we nog beter in staat zijn om een zuiver product in handen te krijgen. Ook kun je met het systeem een superstrakke gradiënt aanleggen, waarbij je niet met stappen van 5 of 10 procent, maar met een constante snelheid telkens de polaire component in je eluens verhoogt. Die eigenschap komt bijvoorbeeld tot zijn recht als je ethylacetaat gebruikt, die ook in het UVgebied absorbeert en dus een basislijn drift geeft. Als je met een gradiënt werkt zie je die basislijn heel regelmatig omhoog gaan, en dan heb je de ELSD om hiervoor te corrigeren.”

 

Maanden werk

Ondanks de snelle tussentijdse opzuiveringsstappen is er nog steeds veel tijd gemoeid met de syntheses. Remco Hofman: “Een stap kan binnen een uur klaar zijn, maar die kan ook zomaar 48 uur duren. We rekenen in de regel met een snelheid van een tot twee stappen per week. Met een tienstappen synthese ben je dan zo maanden bezig. Zeker als het een nieuwe synthese betreft. Want dan testen we eerst in kleine hoeveelheden, bijvoorbeeld voor een halve gram opbrengst, om te kijken of alles naar wens verloopt. Vervolgens schalen we op naar de gewenste batch van in de regel 5 tot 10 gram. Dat lijkt weinig, maar als je bedenkt dat de meeste orders een grootte hebben van enkel tientallen milligrammen tot zo’n honderd miligram, dan kun je daar wel even mee toe. Grotere hoeveelheden maken we ook, maar dan batchgewijs. Voor bijvoorbeeld 20 gram zijn dat dan twee batches van 10 gram. Veel meer maken we meestal niet, al draait er op dit moment een bijzonder project voor 500 gram. Dat is geen weken, maar maanden werk!”

 

Büchi Labortechnik

www.buchi.nl

 

Axon Medchem

www.axonmedchem.com

KENNISPLATFORM VOOR LABORATORIA