De kunst van het maken van een stabiele cellijn

Van de honderden klonen die per therapeutisch interessant antilichaam worden gekweekt, blijft er uiteindelijk maar één over die geschikt is als basis voor de commerciële cellijn voor de GMP-productie ervan. Patrick Priem selecteert met zijn collega’s van de afdeling ‘cell line development’ bij Genmab de optimale cel.

	Patrick Priem, senior research associate bij de afdeling ‘cell line development’ van Genmab.

Elke dag worden er wel ergens op de wereld nieuwe antilichamen gevonden. Maar als je een nieuw target gevonden hebt, moet je niet denken dat je (lang) de enige bent. Vaak wel meerdere groepen en bedrijven werken aan hetzelfde target. Wil je uiteindelijk aan het einde van de rit het bedrijf zijn dat een geneesmiddel op de markt mag brengen op basis van dat target, dan moet alles voor honderd procent kloppen, tot in het kleinste detail. Zo is het zaak om de concurrentie voor te blijven door te blijven innoveren in de productieplatformen, bijvoorbeeld om zo efficiënt mogelijk de cel te vinden die het meest geschikt is voor de uiteindelijke GMP-productie van het antilichaam. Patrick Priem, senior research associate bij de Utrechtse vestiging van het Deense Genmab, beheerst dit uitgebreide selectieproces tot in de finesses. “Het is feitelijk een grote afvalrace. Mijn collega’s beginnen met de transfectie van het DNA dat codeert voor het antilichaam in een gastheercel, bij ons is dat de CHO-cel. Die platen ze uit waarna de cellen groeien in kolonies. Vervolgens testen ze bij elke kolonie of de cellen wel het antilichaam produceren. De goed producerende cellen kweken ze op, waarna ze de eerste testen op stabiliteit en kwaliteit uitvoeren. Produceert een kloon veel multimeren, wat is het glycosyleringsprofiel, enzovoorts. De klonen die deze testen overleven gaan vervolgens elk een microreactor van 7 ml in. Via high throughput screening –we testen er 48 tegelijk– kijk ik hoe ze groeien in de reactor. De cellen krijgen daar te maken met andere omstandigheden: hoe gaan ze om met mechanisch stress, sparging met zuurstof, enzovoorts.” De enkele klonen die hierna overblijven gaan voor de laatste ronde: het simuleren van de exacte reactieomstandigheden in een 2 liter reactor. Die omstandigheden, waaronder type reactor en de feeding strategy, worden bepaald in nauw overleg met de CMO (‘contract manufacturing organization’) waar Genmab de GMP-productie heeft uitbesteed. “Van de cellijn die daarna overblijft weten we zeker dat die het keer op keer goed doet. Die zekerheid moet je ook hebben. De productie is sowieso een kostbare zaak en je wilt de batch-to-batch variatie zo klein mogelijk houden.”

Nauwgezet meten

Patrick Priem meet tijdens het selectieproces tal van parameters om te bepalen hoe de cellen het doen. Belangrijk instrument daarbij is de YSI 7100, een door Salm en Kipp geleverde biochemische analyser. Dit apparaat meet op basis van geïmmobiliseerde enzymtechnologie: een membraan met een bepaald enzym zet een te meten metaboliet om, wat resulteert in een door de sensor te meten stroomsterkte. Ten opzichte van de blanco resulteert dit een concentratie. “Voordeel van de YSi is dat we zes parameters tegelijk kunnen meten. Dat scheelt enorm; we hoeven maar één apparaat te laten draaien, dat in de ochtend al up-and-running is, waardoor we binnen enkele minuten al de eerste metabolietconcentraties weten. Dat verloopt altijd zeer betrouwbaar: dit instrument heeft geen last van de cellen: er raakt nooit iets verstopt; onderhoud is minimaal”, vertelt Priem enthousiast. Het apparaat meet continu glucose/ lactaat, wat een belangrijke graadmeter is voor de groeiomstandigheden in de reactor. “Een te hoge glucoseconcentratie kan alle oxidatieve processen lamleggen. Het lactaat komt dan niet in je Krebs-cyclus, dit leidt tot hogere lactaat concentraties wat je moet neutraliseren met base. Dit leidt tot hogere osmolaire druk met als resultaat slechtere groei en lagere producties. Je kunt dit opvangen door de glucoseconcentratie in de fed batch heel laag te houden”, legt Priem uit. Een andere parameter is lactose/galactose wat van invloed is op het glycosyleringsprofiel. Ook parameters als natrium, kalium en ammonium worden gemeten. Ammonium zie je bijvoorbeeld liever niet te veel want dat geeft aan dat de cellen zich niet helemaal happy voelen. Door feed optimalisatie kan je dan proberen om dergelijke stress factoren weg te nemen.

Nieuwe platformen

Priem heeft in de vijf jaar dat hij bij Genmab werkt al heel wat monoklonale antilichamen voorbij zien komen. Sterproduct van het bedrijf is Arzerra dat inmiddels commercieel op de markt is voor de behandeling van chronische lymfatische leukemie. Bovendien lopen er nog tal van klinische onderzoeken met Arzerra naar de behandeling van andere aandoeningen, zoals reumatoïde artritis. Kracht van dit monoklonale antilichaam is dat het helemaal van humane oorsprong is, wat mogelijk werd dankzij de speciale gentechnologieën en productieprocessen die het bedrijf als één van de eersten ter wereld gebruikt. Voordeel hiervan is een kleinere kans op ongewenste afweerreacties bij de patiënt. Een tweede voordeel is het moleculaire werkingsmechanisme: het monoklonale antilichaam herkent een ander gedeelte van het CD20-eiwit dan bij concurrerende producten, waardoor het al bij een lagere expressie van CD20 tumorcellen doodt. Waar Arzerra nog gemaakt is op basis van het klassieke antilichaam dat aan één antigeen bindt, is Genmab al ver met het ontwikkelen van bispecifieke antilichamen. Bispecifieke antilichamen, zoals Genmab deze ontwikkelt, lijken qua structuur op klassieke monoklonale antilichamen, echter ze hebben een dubbele specificiteit; ze herkennen niet één maar twee targets. “Met deze benadering wordt je ‘therapeutic window’ groter, kan je effectiever op bepaalde mechanismen ingrijpen en specifieker de tumorcellen targetten. Er is dan ook veel belangstelling voor ons bispecifieke antilichaam platform”, vertelt Patrick Priem. De mogelijkheden zijn wat dat betreft nog lang niet opgedroogd. Patrick Priem legt uit: “Een ander vervolgplatform is het zogenaamde ADC-platform, dat kan een bispecifiek of een gewoon antilichaam zijn, en daar koppel je nog een toxine aan. De gedachte hierachter is dat het antilichaam met toxine zich eerst hecht aan de kankercel, die gaat de cel in en het toxine komt los. Dan moet die cel delen wil die toxine gaan werken, en dan gaat die dood. Dat is dus een hele effectieve manier om tumorcellen te doden, omdat je dan niet alleen de effectorfuncties gebruikt, maar zeer tumor-specifiek ook toxines gebruikt. Je bent dus nog effectiever en selectiever, wat weer leidt tot minder bijkomende klachten bij de patiënten. En dat is heel belangrijk, want de patiënten zijn vaak erg ziek; ze kunnen niet al te veel hebben.”

Toekomst

Hoe veelbelovend de eerste resultaten met deze nieuwe platformen ook mogen zijn, het blijft natuurlijk afwachten hoe de klinische studies verlopen. “Wij zetten al onze expertise in om de antilichamen die met deze nieuwe platformen zijn gemaakt zo goed mogelijk te produceren. Zorgen voor een optimale start in de klinische trials, verder kunnen wij niet gaan!”

Salm en Kipp
www.salmenkipp.nl

Genmab
www.genmab.com

LabVision editie 14 | september 2011